Studio pilota sulle infusioni di cellule natural killer aploidentiche reindirizzate per la leucemia linfoblastica acuta di linea B

1.0. Fondamento logico

Contrariamente alla ben consolidata citotossicità delle cellule NK nei confronti delle cellule AML, la loro capacità di lisare TUTTE le cellule è generalmente bassa e difficile da prevedere. Abbiamo cercato di superare questa resistenza intrinseca trasducendo cellule CD56+ CD3-NK con recettori chimerici diretti contro CD19, una molecola ampiamente espressa dalle cellule B maligne. L'espressione dei recettori anti-CD19 legati a CD3zeta ha superato la resistenza NK e l'uccisione mediata dalle cellule NK delle cellule leucemiche è stata notevolmente migliorata. Questo risultato è stato notevolmente migliorato aggiungendo la molecola costimolatoria 4-1BB al recettore chimerico anti-CD19-CD3zeta: la citotossicità prodotta dalle cellule NK che esprimono questo costrutto ha superato uniformemente quella delle cellule NK i cui recettori di segnalazione erano privi di 4-1BB, anche quando la citotossicità naturale era evidente (Imai et al., Blood 2005). Le cellule NK che esprimono i recettori anti-CD19 hanno anche esercitato una vigorosa attività anti-ALL in un modello murino di leucemia (Shimasaki et al., Cytotherapy 2012). I nostri risultati indicano che l'espressione forzata dei recettori di segnalazione da parte delle cellule NK potrebbe aggirare i segnali inibitori, fornendo un nuovo mezzo per migliorare l'efficacia della terapia cellulare anti-ALL NK.

La grande efficacia antileucemica delle cellule NK geneticamente modificate mostrata nei nostri studi preclinici, insieme alla dimostrata fattibilità di infondere cellule NK aploidentiche durevoli in un contesto non HSCT e la consolidata competenza del team NUH nella terapia cellulare (l'unico centro in Asia accreditato dalla Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy, FACT), costituiscono una motivazione convincente per i test clinici di queste cellule NK.

La preparazione del reagente chiave (mRNA anti-CD19-BB-zeta) è finalizzata nel laboratorio Tissue Engineering & Cell Therapy (TECT) presso NUH, dove si trova l'elettroporatore MaxCyte conforme a GMP. La fattibilità dell'espansione su larga scala delle cellule NK è stata dimostrata (Shimasaki et al. Cytotherapy 2012) e la fattibilità dell'elettroporazione su larga scala convalidata nel laboratorio TECT.

Utilizzeremo la citometria a flusso e le tecnologie MRD, per determinare la presenza di malattia persistente, e includeremo in questo studio solo pazienti con una quantità limitata di malattia residua (<1% di linfoblasti leucemici tra le normali cellule del midollo osseo). Useremo gli stessi metodi MRD per monitorare gli effetti delle infusioni terapeutiche. Non ci aspettiamo che il regime di condizionamento abbia molto effetto da solo sulla conta delle cellule leucemiche, poiché i pazienti eleggibili per lo studio avranno una malattia resistente a molti farmaci antileucemici. Tuttavia, poiché il regime di condizionamento stesso può avere alcuni effetti salutari, sarà importante sottoporre a screening il sangue periferico e/o il midollo osseo per la presenza di blasti leucemici durante tutte le fasi della procedura, vale a dire prima, durante e dopo il condizionamento e dopo l'infusione di cellule NK. La presenza di cellule leucemiche sarà attentamente monitorata mediante citometria a flusso o amplificazione PCR dei geni del recettore dell'antigene (sensibilità per entrambi i metodi: 1 cellula leucemica su 10.000) per far luce sull'effetto relativo di ciascun intervento.

2.0. Ipotesi e obiettivi

L'ipotesi principale da testare in questo studio è che l'infusione di cellule NK che esprimono recettori anti-CD19-BB-zeta mediante elettroporazione possa produrre risposte cliniche misurabili in pazienti con LLA di linea B resistente.

3.0. Obiettivi primari

• Determinare la fattibilità e la sicurezza del reindirizzamento delle cellule NK con un recettore dell'antigene chimerico anti-CD19 mediante elettroporazione dell'mRNA in ambito clinico.
• Per determinare l'efficacia delle cellule NK reindirizzate anti-CD19 nei partecipanti alla ricerca con ALL di linea B che hanno una malattia persistente come determinato dai metodi MRD dopo chemioterapia intensiva.

4.0. Obiettivi secondari

• Per studiare la persistenza e il fenotipo delle cellule NK reindirizzate nei partecipanti alla ricerca con ALL di linea B che hanno malattia residua dopo chemioterapia intensiva.

5.0. Endpoint

In questo studio, la risposta al trattamento sarà misurata confrontando i livelli di MRD prima e a diversi intervalli dopo l'infusione di cellule NK. Il raggiungimento della negatività di MRD nel midollo osseo, cioè <0,01% di blasti mediante citometria a flusso o PCR, sarà considerato come una risposta completa . La risposta parziale sarà definita come una diminuzione ≥ 1 log dei livelli di MRD, mentre una diminuzione < 1 log dei livelli di MRD sarà considerata come nessuna risposta.

Sulla base di studi precedenti, le cellule NK del donatore saranno eliminate nella maggior parte dei casi dall'immunità cellulare risorgente del ricevente aploidentico dopo che gli effetti dell'immunosoppressione transitoria causata dal regime di condizionamento sono cessati (tipicamente entro 1 mese dall'infusione). In teoria, tuttavia, l'attecchimento delle cellule NK può persistere per un periodo più lungo con il possibile rischio di pancitopenia prolungata a causa dell'uccisione delle cellule NK sulle normali cellule ematopoietiche. A causa di questa possibilità, pianificheremo il salvataggio dell'HSCT nei pazienti che ricevono infusioni di cellule NK reindirizzate. In effetti, per la maggior parte dei pazienti eleggibili per questo studio, l'HSCT sarebbe l'intervento terapeutico indipendentemente dal fatto che ricevano o meno infusioni di cellule NK. A causa di queste considerazioni, i potenziali benefici della terapia con cellule NK dovrebbero superare i suoi rischi per quei pazienti eleggibili per questo studio, cioè pazienti con leucemia persistente per i quali non è disponibile nessun altro trattamento di provata efficacia.

Poiché il CD19 è universalmente espresso sui linfociti B, inclusi i primi precursori dei linfociti B, il normale linfocita B ricevente sarà anche un bersaglio per le cellule NK del donatore trasdotte con i recettori chimerici anti-CD19. Pertanto, sono attese linfopenia transitoria delle cellule B e ipogammaglobinemia. Monitoreremo la conta delle cellule del sangue CD19 + e misureremo i livelli di Ig una volta al mese e somministreremo ai partecipanti immunoglobuline per via endovenosa (IVIG) se il loro livello di IgG è inferiore agli intervalli specifici per età.

6.0. Sintesi del disegno dello studio

Le cellule del sangue periferico saranno raccolte mediante aferesi dai donatori. Dopo l'espansione ex vivo per 10 giorni mediante cocoltura con cellule K562-mb15-41BBL irradiate (Fujisaki et al, Cancer Res 2009; Lapteva et al. Cytotherapy 2012) e deplezione delle cellule T, cellule NK aploidentiche saranno elettroporate con mRNA anti-CD19-BB-zeta. Prima dell'infusione, i pazienti riceveranno una terapia immunosoppressiva per promuovere l'attecchimento temporaneo delle cellule NK. Dopo l'infusione, riceveranno IL-2 per supportare la vitalità e l'espansione delle cellule NK in vivo. Gli effetti dell'infusione di cellule NK saranno determinati confrontando i livelli di MRD prima e dopo il trattamento.

L'espressione del recettore dopo l'elettroporazione è transitoria e tipicamente diminuisce dopo 48 ore diventando non rilevabile dopo 96 ore. Poiché lo scopo della terapia con cellule NK non è quello di indurre un'immunità duratura ma di ridurre rapidamente il carico di cellule tumorali e le cellule NK infuse vengono respinte dal sistema immunitario dell'ospite dopo circa 2 settimane di infusione, la natura transitoria dell'espressione non dovrebbe influenzare in modo significativo potenziale antitumorale. Inoltre, utilizzando questa strategia, non si applicano problemi di sicurezza relativi alla mutagenesi inserzionale e alla persistenza a lungo termine delle cellule T residue trasdotte. In ogni caso, ridurremo il più possibile il numero di cellule T residue nel prodotto finale esaurendo il prodotto espanso delle cellule T utilizzando il dispositivo CliniMACS e limitando il numero di cellule T nell'innesto a <0,05 x 10^6/kg.