Mottaglighet för mänskliga frivilliga med olika histo-blod med olika histo-blodgruppsantigener för Norovirus

Norovirus är enkelsträngade, positiv-sens RNA-virus som orsakar akut gastroenterit hos människor. Prototypen Norwalk-virus (NV) identifierades i ett stort utbrott av akut gastroenterit i en grundskola i Norwalk, Ohio, 1968. Sedan dess har många stammar beskrivits och namngetts efter platsen för deras första isolering. Genetiskt tillhör Norovirus ett av fyra släkten inom Caliciviridae (CV). Fylogenetisk analys har visat att Norovirus-släktet är indelat i fem genogrupper och varje genogrupp kan vidare delas in i genetiska kluster; minst 30 genetiska kluster av norovirus har identifierats.

Norovirus har erkänts som den viktigaste orsaken till icke-bakteriella epidemier av akut gastroenterit, som drabbar individer i alla åldrar, i både utvecklingsländer och utvecklade länder. Sådana utbrott har vanligtvis höga attackfrekvenser och har inträffat i barnomsorg, skolor, restauranger, sommarläger, sjukhus, vårdhem, fartyg (både civila och militära) samt utplacerade militära trupper. Virusen är mycket smittsamma och kan överleva i miljön under längre perioder. De sprids genom kontakt med ytor i omgivningen och överföring från person till person. Norovirus orsakar normalt måttlig till svår diarré och sjukdomen är ofta invalidiserande och kan vara dödlig hos unga och äldre. Det viktigaste folkhälsoproblemet är att Norovirus kan orsaka stora vatten- och livsmedelsburna utbrott, vilket resulterar i att viruset klassificeras som ett kategori B-agens.

Norovirus har också varit inblandade i flera militära utbrott. "Desert Shield-viruset" (DSV) som isolerades i amerikanska trupper under Gulfkriget 1991 identifierades därefter som ett Norovirus. På samma sätt orsakades de nyligen rapporterade "mystiska" attackerna av akut gastroenterit som drabbade de brittiska trupperna i Afghanistan av ett Norovirus. Stora utbrott av Norovirus-associerad gastroenterit är vanliga på US Navy-fartyg, liknande de som inträffade ombord på kryssningsfartyg. Övervakning av akut gastroenterit ombord på fem amerikanska flottans stridsfartyg 1998-1999 visade att alla fartyg upplevde stora utbrott av Norovirus akut gastroenterit under sin utplacering i Stilla havet och Indiska oceanen, efter hamnbesök. På grund av den snabba spridningen av sjukdomen kunde många avdelningar och enheter ombord på fartygen inte fungera under toppen av utbrotten.

Norovirus är svåra att studera eftersom: 1) de är genetiskt och antigeniskt mycket olika och flera stammar med distinkta genetiska identiteter samcirkulerar i samma samhällen, vilket gör diagnos och sjukdomskontroll extremt svår; och 2) viruset kan inte odlas i cellkultur och 3) ingen liten djurmodell för att studera norovirus existerar. Den molekylära kloningen av prototypen Norwalk Virus (NV) 1990 av en av medutredarna av denna ansökan har möjliggjort snabba framsteg i att studera Norovirus och andra släkten; men många frågor om Norovirusinfektion, patogenes, immunologi och värdområde förblir okända.

Upptäckten av Norovirus-receptorer ger nya möjligheter att utvärdera patogenesen och epidemiologin hos Norovirus. En genetisk värdfaktor som involverar Norovirusinfektion föreslogs ursprungligen av många forskare före kloningen av Norovirus på 1990-talet eftersom cirka 20-30 % av individer som inte hade antikroppar mot Norovirus aldrig infekterades efter en utmaning med NV, och vid utbrott, individer som förblev friska grupperades i familjer som hade samma exponering för Norovirus som de sjuka familjerna. Vidare var redan existerande antikroppar mot NV inte skyddande mot NV-infektion, medan individer som hade höga nivåer av antikroppar mot NV var mer mottagliga för NV än individer som inte hade antikropparna. Dessa observationer indikerar att det, förutom immunsvar, måste finnas en annan faktor(er) som styr värdspecificiteten för Norovirusinfektion.

Vi upptäckte nyligen att Norovirus känner igen humana histo-blodgruppsantigener som receptorer. Genom att använda rekombinanta kapsidproteiner från olika Norovirus som representerar olika genetiska kluster har vi identifierat fyra bindningsmönster av Norovirus till humana histo-blodgruppsantigener, vilka definieras av värden Lewis, sekretor och ABO-blodtyper. Detta fynd ger ett nytt tillvägagångssätt för att utveckla strategier för att kontrollera sjukdomen. Specifikt, om Norovirus förlitar sig på histo-blodgruppsantigener på ytorna av tarmepitelcellerna som receptorer, kan en förening som hämmar interaktionen mellan viruset och receptorerna utvecklas som ett antiviralt läkemedel för Norovirus. Detta fynd utgör grunden för detta protokoll som försöker bekräfta sambandet mellan specifik Norovirus-känslighet och specifik histo-blodgruppsantigennärvaro samt etablera en modell för att utvärdera framtida interventioner (läkemedel och vacciner).

Specificiteten hos NV-interaktionen med sockerdelarna i histo-blodgruppsantigener visades genom specifik blockering av bindningen av bröstmjölk från en sekretor, av monoklonala antikroppar specifika för sekretoriska humana blodgruppsantigener (HBGA), av syntetiska oligosackaridkonjugat innehållande sekretorantigener, och genom behandling av vävnaderna med al,2-fukosidas. NV binder också till differentierade CaCo2-celler och differentierade CaCo2-celler uttrycker humana histo-blodgruppsantigener. Transfektion av kinesisk hamster ovarieceller (CHO) med en al,2-kopplad fucosyl-transferas cDNA möjliggjorde vidhäftning av NV virusliknande partiklar (VLPs). De bundna rNV VLP:erna internaliserades efter inkubation av cellerna vid 37oC.

För att ytterligare undersöka sambandet mellan sekretorstatus och känslighet för Norwalk-virus (NV), samarbetade vi med Dr. Christine Moe vid Emory University's School of Medicine i en frivillig utmaningsstudie. Denna studie använde prototypen NV, den första Norovirus-stammen som användes för humana utmaningsstudier. Salivprover från 77 NV-utmanade frivilliga testades för sekretorstatus och för NV-bindning. Femtiofem (71%) av de 77 frivilliga var sekreterare. Bland de 55 sekretorerna infekterades 34 (62%) med NV efter utmaning och saliv från 41 (75%) bundna NV-rekombinanta VLP. Inget av salivproverna från de 22 frivilliga som inte utsöndrade band band NV-virusliknande partiklar (VLP) och ingen av dem blev infekterad efter NV-provokation; vilket starkt tyder på att känsligheten för NV bestäms åtminstone delvis av värdens förmåga att binda norovirusstammen.

Mer nyligen utförde vi en studie för att fastställa om andra stammar av Norovirus har ett liknande mönster av värdspecificitet och har utökat bindningsmönstren till 7 baserat på undersökning av fjorton Norovirus. De 7 mönstren har klassificerats i två grupper enligt deras interaktioner med tre huvudepitoper (A/B, H och Lewis) av HBGA: den A/B-bindande gruppen och den Lewis-bindande gruppen. Stammar i den A/B-bindande gruppen känner igen A- och/eller B- och H-antigenerna, men inte Lewis-antigenerna, medan stammar i den Lewis-bindande gruppen endast reagerar på Lewis- och/eller H-antigenerna. Denna klassificering resulterade också i en modell av Norovirus/HBGA-interaktionen, i vilken maximalt två bindningsställen inom ett receptorbindande gränssnitt är involverade i NV/HBGA-interaktion. A-, B- och H-sidokedjorna är ansvariga för bindning av de A/B-bindande stammarna medan Lewis-epitoperna är ansvariga för de Lewis-bindande stammarna. Fylogenetiska analyser visade att stammar med identiska eller närbesläktade bindningsmönster tenderade att klustras, men stammar i båda bindningsgrupperna kan hittas i både genogrupper I och II. Våra resultat tyder på att Norovirus har ett brett spektrum av värdområde och mänskliga HBGAs spelar en viktig roll i Norovirusutvecklingen.

Eftersom humana norovirus inte kan odlas in vitro eller infektera djur, är det nödvändigt att utföra humana frivilliga utmaningsstudier för att studera infektionens patobiologi. Studien kommer att främja konceptet att Norovirus har ett smalt värdområde som är grundläggande för patogenesen och immunologin för Norovirus. Dessutom har vi nyligen identifierat mer än ett dussin föreningar som specifikt blockerar Norovirus-bindning till sina receptorer. Den mänskliga utmaningsstudien bör också etablera en modell som kan användas i utvärderingen av dessa nya föreningar med avseende på deras förmåga att blockera virusreplikation (antiviralt läkemedel). Dessutom kommer vår studie att omvärdera om förvärvad immunitet är en oberoende faktor i Norovirusinfektioner som kan ge ytterligare information om värdimmunitet som potentiellt är användbar vid vaccinutveckling. Slutligen kommer studien att möjliggöra banking av Norovirus-utmaningsstammen genom att samla in diarréavföring som passerat av studiepersonerna. Banking av ytterligare prover, som nämnts ovan, är avgörande för framtida kliniska prövningar eftersom viruset inte kan odlas in vitro och måste isoleras från människor infekterade med viruset.

En specifik utmaningsstudie skulle endast använda en utmaningsstam och varje utmaningsstam som används i humana kliniska prövningar skulle ha ett separat IND- och FDA-godkännande före administrering till försökspersoner.