Citlivost lidských dobrovolníků s různou histo-krev s různými antigeny histo-krevní skupiny na norovirus

Noroviry jsou jednovláknové RNA viry s pozitivním smyslem, které způsobují akutní gastroenteritidu u lidí. Prototyp viru Norwalk (NV) byl identifikován při velkém propuknutí akutní gastroenteritidy na základní škole v Norwalk, Ohio, v roce 1968. Od té doby bylo popsáno a pojmenováno mnoho kmenů podle míst jejich první izolace. Geneticky patří noroviry k jednomu ze čtyř rodů Caliciviridae (CV). Fylogenetická analýza ukázala, že rod Norovirus je rozdělen do pěti genoskupin a každá genoskupina může být dále rozdělena do genetických shluků; bylo identifikováno nejméně 30 genetických shluků norovirů.

Noroviry byly uznány jako nejdůležitější příčina nebakteriálních epidemií akutní gastroenteritidy postihující jedince všech věkových kategorií v rozvojových i rozvinutých zemích. Taková ohniska mají obvykle vysokou míru útoků a vyskytla se v dětských centrech, školách, restauracích, letních táborech, nemocnicích, pečovatelských domech, na lodích (civilních i vojenských) i v nasazených vojenských jednotkách. Viry jsou vysoce nakažlivé a jsou schopny přežít v prostředí po delší dobu. Šíří se kontaktem s okolními povrchy a přenosem z člověka na člověka. Noroviry normálně způsobují středně těžký až těžký průjem a onemocnění je často invalidizující a může být smrtelné u mladých a starších osob. Nejzávažnějším problémem veřejného zdraví je, že noroviry mohou způsobit velká ohniska přenášená vodou a potravinami, což vede k tomu, že je virus klasifikován jako agens kategorie B.

Noroviry byly také zapojeny do několika vojenských ohnisek. „Virus Desert Shield“ (DSV) izolovaný v amerických jednotkách během války v Perském zálivu v roce 1991 byl následně identifikován jako norovirus. Podobně nedávno hlášené "záhadné" záchvaty akutní gastroenteritidy postihující britské jednotky v Afghánistánu byly také způsobeny norovirem. Velká ohniska gastroenteritidy související s Norovirem jsou na lodích amerického námořnictva běžná, podobná těm, ke kterým došlo na palubách výletních lodí. Sledování akutní gastroenteritidy na palubě pěti bojových lodí amerického námořnictva v letech 1998-1999 ukázalo, že všechny lodě prodělaly velké propuknutí akutní gastroenteritidy Noroviru během jejich nasazení v Tichém a Indickém oceánu po návštěvách přístavů. Kvůli rychlému šíření nemoci nebylo mnoho oddělení a jednotek na palubě lodí schopno fungovat během vrcholu ohnisek.

Noroviry je obtížné studovat, protože: 1) jsou geneticky a antigenně velmi různorodé a ve stejných komunitách kocirkulují četné kmeny s odlišnými genetickými identitami, což činí diagnostiku a kontrolu nemoci extrémně obtížnou; a 2) virus nelze kultivovat v buněčné kultuře a 3) neexistuje žádný malý zvířecí model pro studium norovirů. Molekulární klonování prototypu Norwalk Virus (NV) v roce 1990 jedním ze spoluřešitelů této aplikace umožnilo rychlý pokrok ve studiu norovirů a dalších rodů; mnoho otázek týkajících se norovirové infekce, patogeneze, imunologie a rozsahu hostitelů však zůstává neznámých.

Objev norovirových receptorů poskytuje nové příležitosti k hodnocení patogeneze a epidemiologie norovirů. Genetický faktor hostitele zahrnující infekci noroviry byl původně navržen mnoha výzkumníky před klonováním norovirů v 90. letech 20. století, protože asi 20–30 % jedinců, kteří neměli protilátky proti noroviru, nebylo nikdy infikováno po infekci NV a v ohniscích se jedinci kteří zůstali zdraví, byli seskupeni v rodinách, které měly stejnou expozici norovirů jako nemocné rodiny. Dále, již existující protilátky proti NV nebyly ochranné proti infekci NV, zatímco jedinci, kteří měli vysoké hladiny protilátek proti NV, byli náchylnější k NV než jedinci, kteří protilátky neměli. Tato pozorování naznačují, že kromě imunitních odpovědí musí existovat další faktor (faktory), který řídí hostitelskou specifitu norovirové infekce.

Nedávno jsme zjistili, že noroviry rozpoznávají lidské histo-antigeny krevní skupiny jako receptory. Pomocí rekombinantních kapsidových proteinů z různých norovirů reprezentujících různé genetické klastry jsme identifikovali čtyři vazebné vzorce norovirů k antigenům lidské histo-krevní skupiny, které jsou definovány hostitelskými Lewisovými, sekrečními a ABO krevními skupinami. Toto zjištění poskytuje nový přístup k vývoji strategií pro kontrolu onemocnění. Konkrétně, pokud se noroviry spoléhají na antigeny histo-krevní skupiny na povrchu buněk střevního epitelu jako receptory, sloučenina, která inhibuje interakci mezi virem a receptory, by mohla být vyvinuta jako antivirotikum pro noroviry. Toto zjištění poskytuje základ pro tento protokol, který se snaží potvrdit vztah mezi specifickou citlivostí noroviru a specifickou přítomností antigenu histo-krevní skupiny a také vytvořit model pro hodnocení budoucích intervencí (léky a vakcíny).

Specifičnost interakce NV s cukernými skupinami histo-antigenů krevní skupiny byla prokázána specifickým blokováním vazby lidským mlékem ze sekretoru, monoklonálními protilátkami specifickými pro sekreční antigeny lidské krevní skupiny (HBGA), syntetickými oligosacharidovými konjugáty obsahující sekreční antigeny a ošetřením tkání a1,2-fukosidázou. NV se také váže na diferencované buňky CaCo2 a diferencované buňky CaCo2 exprimují antigeny lidské histo-krevní skupiny. Transfekce buněk vaječníků čínského křečka (CHO) cDNA a1,2-vázané fukosyl-transferázy umožnila připojení NV viru podobných částic (VLP). Navázané rNV VLP byly internalizovány po inkubaci buněk při 37 °C.

Abychom dále prozkoumali souvislost mezi stavem sekretorů a vnímavostí k viru Norwalk (NV), spolupracovali jsme s Dr. Christine Moe na lékařské fakultě Emory University na dobrovolnické provokační studii. Tato studie používala prototyp NV, první kmen noroviru, který byl použit pro studie provokační expozice u lidí. Vzorky slin od 77 dobrovolníků infikovaných NV byly testovány na stav sekretorů a na vazbu NV. Padesát pět (71 %) ze 77 dobrovolníků byli sekretáři. Z 55 sekretorů bylo 34 (62 %) infikováno NV po expozici a slinami ze 41 (75 %) navázaných NV rekombinantních VLP. Žádný ze vzorků slin od 22 nevylučujících dobrovolníků nevázal částice podobné viru NV (VLP) a žádný z nich se neinfikoval po expozici NV; silně naznačuje, že citlivost k NV je určena alespoň částečně schopností hostitele vázat kmen noroviru.

Nedávno jsme provedli studii, abychom zjistili, zda jiné kmeny norovirů mají podobný vzorec hostitelské specifity a rozšířili jsme vazebné vzorce na 7 na základě zkoumání čtrnácti norovirů. Těchto 7 vzorů bylo klasifikováno do dvou skupin podle jejich interakcí se třemi hlavními epitopy (A/B, H a Lewis) HBGA: A/B vazebná skupina a Lewisova vazebná skupina. Kmeny ve skupině vázající se A/B rozpoznávají antigeny A a/nebo B a H, ale ne antigeny Lewis, zatímco kmeny ve skupině vázající Lewis reagují pouze na antigeny Lewis a/nebo H. Tato klasifikace také vyústila v model interakce Norovirus/HBGA, ve kterém jsou do interakce NV/HBGA zapojena maximálně dvě vazebná místa v rámci receptorového vazebného rozhraní. Postranní řetězce A, B a H jsou zodpovědné za vazbu A/B vazebných kmenů, zatímco Lewisovy epitopy jsou zodpovědné za Lewis vazebné kmeny. Fylogenetické analýzy ukázaly, že kmeny s identickými nebo blízce příbuznými vazebnými vzory měly tendenci se shlukovat, ale kmeny v obou vazebných skupinách lze nalézt v obou genoskupinách I a II. Naše výsledky naznačují, že noroviry mají široké spektrum hostitelů a lidské HBGA hrají důležitou roli v evoluci noroviru.

Vzhledem k tomu, že lidské noroviry nelze kultivovat in vitro nebo infikovat zvířata, je nutné provést provokační studie u lidských dobrovolníků pro studium patobiologie infekce. Studie bude podporovat koncept, že Norovirus má úzký rozsah hostitelů, který je zásadní v patogenezi a imunologii norovirů. Kromě toho jsme nedávno identifikovali více než tucet sloučenin, které specificky blokují připojení noroviru k jejich receptorům. Studie expozice u lidí by také měla vytvořit model, který lze použít při hodnocení těchto nových sloučenin s ohledem na jejich schopnost blokovat replikaci viru (antivirové léčivo). Kromě toho naše studie přehodnotí, zda získaná imunita je nezávislým faktorem u norovirových infekcí, což může poskytnout další informace o imunitě hostitele potenciálně užitečné při vývoji vakcíny. Konečně, studie umožní bankovnictví kmene Norovirus provokačního kmene shromažďováním průjmové stolice procházející subjekty studie. Banka dalšího vzorku, jak je uvedeno výše, je kritická pro budoucí klinické studie, protože virus nelze kultivovat in vitro a musí být izolován od lidí infikovaných virem.

Specifická čelenžní studie by používala pouze jeden čelenžní kmen a jakýkoli čelenžní kmen použitý v klinických studiích na lidech by měl před podáním subjektům samostatné schválení IND a FDA.