Gevoeligheid van menselijke vrijwilligers met verschillend histo-bloed met verschillende histo-bloedgroepantigenen voor norovirus

Norovirussen zijn enkelstrengs, positive-sense RNA-virussen die acute gastro-enteritis bij mensen veroorzaken. Het prototype Norwalk-virus (NV) werd geïdentificeerd tijdens een grote uitbraak van acute gastro-enteritis op een basisschool in Norwalk, Ohio, in 1968. Sindsdien zijn veel stammen beschreven en benoemd naar de locatie van hun eerste isolatie. Norovirussen behoren genetisch gezien tot een van de vier geslachten binnen Caliciviridae (CV). Fylogenetische analyse heeft aangetoond dat het Norovirus-geslacht is verdeeld in vijf genogroepen en dat elke genogroep verder kan worden onderverdeeld in genetische clusters; er zijn ten minste 30 genetische clusters van norovirussen geïdentificeerd.

Norovirussen zijn erkend als de belangrijkste oorzaak van niet-bacteriële epidemieën van acute gastro-enteritis, die individuen van alle leeftijden treffen, zowel in ontwikkelingslanden als in ontwikkelde landen. Dergelijke uitbraken hebben meestal hoge aanvalspercentages en hebben plaatsgevonden in kinderopvangcentra, scholen, restaurants, zomerkampen, ziekenhuizen, verpleeghuizen, schepen (zowel civiel als militair) en ingezette militaire troepen. De virussen zijn zeer besmettelijk en kunnen gedurende langere tijd in het milieu overleven. Ze worden verspreid door contact met omgevingsoppervlakken en overdracht van persoon op persoon. Norovirussen veroorzaken normaal gesproken matige tot ernstige diarree en de ziekte is vaak invaliderend en kan dodelijk zijn bij jongeren en ouderen. De belangrijkste zorg voor de volksgezondheid is dat norovirussen grote door water en voedsel overgedragen uitbraken kunnen veroorzaken, waardoor het virus wordt geclassificeerd als een categorie B-agens.

Norovirussen zijn ook betrokken bij verschillende militaire uitbraken. Het "Desert Shield-virus" (DSV) dat tijdens de Golfoorlog van 1991 in Amerikaanse troepen werd geïsoleerd, werd vervolgens geïdentificeerd als een norovirus. Evenzo werden de onlangs gerapporteerde "mysterieuze" aanvallen van acute gastro-enteritis die de Britse troepen in Afghanistan troffen, ook veroorzaakt door een norovirus. Grote uitbraken van norovirus-geassocieerde gastro-enteritis komen vaak voor op Amerikaanse marineschepen, vergelijkbaar met die aan boord van cruiseschepen. Surveillance van acute gastro-enteritis aan boord van vijf gevechtsschepen van de Amerikaanse marine in 1998-1999 toonde aan dat alle schepen grote uitbraken van norovirus acute gastro-enteritis doormaakten tijdens hun inzet in de Stille en Indische Oceaan, na havenbezoeken. Door de snelle verspreiding van de ziekte konden veel afdelingen en eenheden aan boord van de schepen niet functioneren tijdens het hoogtepunt van de uitbraken.

Norovirussen zijn moeilijk te bestuderen omdat: 1) ze genetisch en antigeen zeer divers zijn en meerdere stammen met verschillende genetische identiteiten samen in dezelfde gemeenschappen circuleren, wat diagnose en ziektebestrijding uiterst moeilijk maakt; en 2) het virus kan niet worden gekweekt in celkweek en 3) er bestaat geen klein diermodel voor het bestuderen van Norovirussen. De moleculaire klonering van het prototype Norwalk Virus (NV) in 1990 door een van de mede-onderzoekers van deze toepassing heeft snelle vooruitgang mogelijk gemaakt bij het bestuderen van Norovirussen en andere geslachten; veel problemen met Norovirus-infectie, pathogenese, immunologie en gastheerbereik blijven echter onbekend.

De ontdekking van norovirusreceptoren biedt nieuwe mogelijkheden om de pathogenese en epidemiologie van norovirussen te evalueren. Een gastheergenetische factor waarbij Norovirus-infectie betrokken was, werd oorspronkelijk door veel onderzoekers gesuggereerd vóór het klonen van Norovirussen in de jaren negentig, omdat ongeveer 20-30% van de individuen die geen antilichamen tegen Norovirussen hadden, nooit werden geïnfecteerd na een uitdaging met NV, en bij uitbraken, individuen die gezond bleven, werden geclusterd in gezinnen die dezelfde blootstelling aan norovirussen hadden als de zieke gezinnen. Verder waren reeds bestaande antilichamen tegen NV niet beschermend tegen NV-infectie, terwijl individuen met hoge niveaus van antilichamen tegen NV vatbaarder waren voor NV dan individuen die de antilichamen niet hadden. Deze waarnemingen geven aan dat er, naast immuunresponsen, nog een andere factor(en) moet zijn die de gastheerspecificiteit van Norovirus-infectie regelt.

We hebben onlangs ontdekt dat norovirussen humane histo-bloedgroepantigenen als receptoren herkennen. Met behulp van recombinante capside-eiwitten van verschillende norovirussen die verschillende genetische clusters vertegenwoordigen, hebben we vier bindingspatronen van norovirussen aan humane histo-bloedgroepantigenen geïdentificeerd, die worden gedefinieerd door de Lewis-, secretor- en ABO-bloedgroepen van de gastheer. Deze bevinding biedt een nieuwe benadering om strategieën te ontwikkelen om de ziekte onder controle te krijgen. Specifiek, als norovirussen vertrouwen op de histo-bloedgroepantigenen op de oppervlakken van de darmepitheelcellen als receptoren, zou een verbinding die de interactie tussen het virus en receptoren remt, kunnen worden ontwikkeld als een antiviraal geneesmiddel voor norovirussen. Deze bevinding vormt de basis voor dit protocol dat tot doel heeft de relatie tussen specifieke Norovirus-gevoeligheid en specifieke histo-bloedgroepantigeenaanwezigheid te bevestigen en een model vast te stellen om toekomstige interventies (geneesmiddelen en vaccins) te evalueren.

De specificiteit van de NV-interactie met de suikerdelen van histo-bloedgroepantigenen werd aangetoond door specifieke blokkering van de binding door moedermelk van een secretor, door monoklonale antilichamen die specifiek zijn voor secretor humane bloedgroepantigenen (HBGA's), door synthetische oligosaccharideconjugaten. die secretorantigenen bevatten, en door behandeling van de weefsels met a1,2-fucosidase. NV bindt ook aan gedifferentieerde CaCo2-cellen en gedifferentieerde CaCo2-cellen brengen menselijke histo-bloedgroepantigenen tot expressie. Transfectie van ovariumcellen van de Chinese hamster (CHO) met een a1,2-gekoppeld fucosyltransferase-cDNA maakte aanhechting van NV-virusachtige deeltjes (VLP's) mogelijk. De gebonden rNV VLP's werden geïnternaliseerd na incubatie van de cellen bij 37oC.

Om het verband tussen secretorstatus en vatbaarheid voor het Norwalk-virus (NV) verder te onderzoeken, werkten we samen met Dr. Christine Moe aan de Emory University's School of Medicine aan een vrijwillig challenge-onderzoek. Deze studie maakte gebruik van het prototype NV, de eerste Norovirus-stam die werd gebruikt voor humane provocatiestudies. Speekselmonsters van 77 NV-uitgedaagde vrijwilligers werden getest op secretorstatus en op NV-binding. Vijfenvijftig (71%) van de 77 vrijwilligers waren secretors. Van de 55 secretors waren er 34 (62%) geïnfecteerd met NV na provocatie en speeksel van 41 (75%) gebonden NV recombinante VLP's. Geen van de speekselmonsters van de 22 niet-uitscheidende vrijwilligers bond NV-virusachtige deeltjes (VLP's) en geen van hen raakte geïnfecteerd na NV-challenge; wat sterk suggereert dat de gevoeligheid voor NV ten minste gedeeltelijk wordt bepaald door het vermogen van de gastheer om de norovirusstam te binden.

Meer recentelijk hebben we een studie uitgevoerd om te bepalen of andere stammen van norovirussen een vergelijkbaar patroon van gastheerspecificiteit hebben en hebben we de bindingspatronen uitgebreid tot 7 op basis van onderzoek van veertien norovirussen. De 7 patronen zijn geclassificeerd in twee groepen volgens hun interacties met drie belangrijke epitopen (A/B, H en Lewis) van HBGA's: de A/B-bindende groep en de Lewis-bindende groep. Stammen in de A/B-bindende groep herkennen de A- en/of B- en H-antigenen, maar niet de Lewis-antigenen, terwijl stammen in de Lewis-bindende groep alleen reageren op de Lewis- en/of H-antigenen. Deze classificatie resulteerde ook in een model van de Norovirus/HBGA-interactie, waarin maximaal twee bindingsplaatsen binnen een receptorbindingsinterface betrokken zijn bij de NV/HBGA-interactie. De A-, B- en H-zijketens zijn verantwoordelijk voor binding door de A/B-bindende stammen, terwijl de Lewis-epitopen verantwoordelijk zijn voor de Lewis-bindende stammen. Fylogenetische analyses toonden aan dat stammen met identieke of nauw verwante bindingspatronen de neiging hadden om geclusterd te zijn, maar stammen in beide bindingsgroepen kunnen worden gevonden in zowel genogroep I als II. Onze resultaten suggereren dat norovirussen een breed spectrum aan gastheerbereik hebben en dat menselijke HBGA's een belangrijke rol spelen in de evolutie van het norovirus.

Aangezien humane norovirussen niet in vitro kunnen worden gekweekt of dieren kunnen infecteren, is het noodzakelijk om humane vrijwilligersprovocatiestudies uit te voeren om de pathobiologie van de infectie te bestuderen. De studie zal het concept bevorderen dat norovirus een smal gastheerbereik heeft, wat fundamenteel is in de pathogenese en immunologie van norovirussen. Bovendien hebben we onlangs meer dan een dozijn verbindingen geïdentificeerd die specifiek norovirushechting aan hun receptoren blokkeren. De humane challenge-studie zou ook een model moeten opleveren dat kan worden gebruikt bij de evaluatie van deze nieuwe verbindingen met betrekking tot hun vermogen om virusreplicatie te blokkeren (antiviraal geneesmiddel). Bovendien zal onze studie opnieuw evalueren of verworven immuniteit een onafhankelijke factor is bij norovirusinfecties, wat aanvullende informatie kan opleveren over de immuniteit van de gastheer die mogelijk nuttig is bij de ontwikkeling van vaccins. Ten slotte zal de studie het mogelijk maken om de Norovirus-uitdagingsstam op te slaan door de diarree-ontlasting te verzamelen die door de proefpersonen wordt doorgegeven. Zoals hierboven vermeld, is het bewaren van extra exemplaren van cruciaal belang voor toekomstige klinische onderzoeken, omdat het virus niet in vitro kan worden gekweekt en moet worden geïsoleerd van mensen die met het virus zijn geïnfecteerd.

Een specifieke challenge-studie zou slechts één challenge-stam gebruiken en elke challenge-stam die in klinische proeven bij mensen wordt gebruikt, zou een afzonderlijke IND- en FDA-goedkeuring hebben voorafgaand aan toediening aan proefpersonen.