Vapaaehtoisten ihmisten, joilla on erilainen histo-veri ja erilaiset histo-veriryhmän antigeenit, herkkyys norovirukselle

Norovirukset ovat yksijuosteisia, positiivisia RNA-viruksia, jotka aiheuttavat akuuttia gastroenteriittiä ihmisellä. Prototyyppi Norwalk-virus (NV) tunnistettiin laajassa akuutin gastroenteriitin puhkeamisessa ala-asteella Norwalkissa Ohiossa vuonna 1968. Siitä lähtien monia kantoja on kuvattu ja nimetty niiden ensimmäisen eristyspaikan mukaan. Geneettisesti Norovirukset kuuluvat yhteen neljästä Caliciviridae (CV) -suvusta. Fylogeneettinen analyysi on osoittanut, että Norovirus-suku on jaettu viiteen genoryhmään ja jokainen genoryhmä voidaan jakaa edelleen geneettisiin klustereihin; ainakin 30 norovirusten geneettistä klusteria on tunnistettu.

Norovirukset on tunnustettu akuutin gastroenteriitin ei-bakteeriepidemioiden tärkeimmäksi aiheuttajaksi, ja ne vaikuttavat kaikenikäisiin yksilöihin sekä kehitys- että kehittyneissä maissa. Tällaisilla taudinpurkauksilla on yleensä korkea hyökkäysaste, ja niitä on esiintynyt päiväkodeissa, kouluissa, ravintoloissa, kesäleireillä, sairaaloissa, hoitokodeissa, laivoissa (sekä siviili- että sotilashenkilöstössä) sekä lähetetyissä sotilasjoukoissa. Virukset ovat erittäin tarttuvia ja pystyvät selviytymään ympäristössä pitkiä aikoja. Ne leviävät kosketuksesta ympäristön pintoihin ja tarttuvat ihmisestä toiseen. Norovirukset aiheuttavat tavallisesti kohtalaista tai vaikeaa ripulia, ja tauti on usein toimintakyvytön ja voi johtaa kuolemaan nuorilla ja vanhuksilla. Suurin kansanterveyshuolenaihe on se, että norovirukset voivat aiheuttaa suuria vesi- ja ruokavälitteisiä taudinpurkauksia, minkä seurauksena virus luokitellaan B-luokan taudinaiheuttajaksi.

Norovirukset ovat myös olleet osallisena useissa sotilaallisissa epidemioissa. Yhdysvaltain joukkoissa vuoden 1991 Persianlahden sodassa eristetty "Desert Shield virus" (DSV) tunnistettiin myöhemmin norovirukseksi. Samoin äskettäin raportoidut "salaperäiset" akuutin maha-suolitulehduksen hyökkäykset, jotka koskivat brittijoukkoja Afganistanissa, johtuivat myös Noroviruksesta. Suuret Norovirukseen liittyvän gastroenteriittien puhkeaminen ovat yleisiä Yhdysvaltain laivaston aluksilla, samankaltaisia ​​kuin risteilyaluksilla. Yhdysvaltain laivaston viidellä taistelualuksella vuosina 1998-1999 suoritettu akuutin gastroenteriitin seuranta osoitti, että kaikissa aluksissa esiintyi suuria Norovirus-akuutin gastroenteriitin puhkeamista niiden käyttöönoton aikana Tyynellämerellä ja Intian valtamerellä satamakäyntien jälkeen. Taudin nopean leviämisen vuoksi monet laivoilla olleet osastot ja yksiköt eivät pystyneet toimimaan epidemioiden huipun aikana.

Noroviruksia on vaikea tutkia, koska: 1) ne ovat geneettisesti ja antigeenisesti erittäin monimuotoisia ja useita kantoja, joilla on selkeä geneettinen identiteetti, kiertävät yhdessä samoissa yhteisöissä, mikä tekee diagnoosista ja taudin hallinnasta erittäin vaikeaa; ja 2) virusta ei voida viljellä soluviljelmässä ja 3) ei ole olemassa pieneläinmallia norovirusten tutkimiseen. Prototyypin Norwalk Virus (NV) molekyylikloonaus vuonna 1990, jonka yksi tämän hakemuksen tutkijoista on mahdollistanut nopean edistymisen Norovirusten ja muiden sukujen tutkimisessa; monet Norovirusinfektioon, patogeneesiin, immunologiaan ja isäntävalikoimaan liittyvät ongelmat ovat kuitenkin edelleen tuntemattomia.

Norovirusreseptorien löytäminen tarjoaa uusia mahdollisuuksia arvioida norovirusten patogeneesiä ja epidemiologiaa. Monet tutkijat ehdottivat alun perin isännän geneettistä tekijää, johon liittyy Norovirusinfektio, ennen norovirusten kloonausta 1990-luvulla, koska noin 20-30 % henkilöistä, joilla ei ollut vasta-aineita noroviruksia vastaan, ei koskaan saanut tartuntaa NV-altistuksen jälkeen, ja taudinpurkauksissa yksilöt terveinä pysyneet ryhmittyivät perheisiin, joissa oli sama altistuminen noroviruksille kuin sairaille perheille. Lisäksi olemassa olevat vasta-aineet NV:tä ​​vastaan ​​eivät olleet suojaavia NV-infektiota vastaan, kun taas yksilöt, joilla oli korkeat NV-vasta-aineiden tasot, olivat alttiimpia NV:lle kuin henkilöt, joilla ei ollut vasta-aineita. Nämä havainnot osoittavat, että immuunivasteiden lisäksi täytyy olla toinen tekijä, joka säätelee Norovirusinfektion isäntäspesifisyyttä.

Havaitsimme äskettäin, että norovirukset tunnistavat ihmisen histoveriryhmän antigeenit reseptoreina. Käyttämällä rekombinanttikapsidiproteiineja eri noroviruksista, jotka edustavat erilaisia ​​geneettisiä klustereita, olemme tunnistaneet neljä norovirusten sitoutumismallia ihmisen histo-veriryhmän antigeeneihin, jotka määritellään isäntä Lewis-, sekretor- ja ABO-verityypeillä. Tämä havainto tarjoaa uuden lähestymistavan kehittää strategioita taudin hallintaan. Tarkemmin sanottuna, jos norovirukset luottavat suoliston epiteelisolujen pinnoilla oleviin histo-veriryhmän antigeeneihin reseptoreina, viruksen ja reseptorien välistä vuorovaikutusta estävää yhdistettä voitaisiin kehittää antiviraaliseksi lääkkeeksi noroviruksille. Tämä havainto tarjoaa perustan tälle protokollalle, jolla pyritään vahvistamaan yhteys spesifisen norovirusherkkyyden ja spesifisen histoveriryhmän antigeenin esiintymisen välillä sekä luomaan malli tulevien interventioiden (lääkkeiden ja rokotteiden) arvioimiseksi.

NV-vuorovaikutuksen spesifisyys histoveriryhmän antigeenien sokeriosien kanssa osoitettiin spesifisellä estämällä ihmisen maidon sitoutuminen erittäjästä, monoklonaalisilla vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä erittäviä ihmisen veriryhmän antigeenejä (HBGA:t), synteettisillä oligosakkaridikonjugaateilla. jotka sisältävät erittäviä antigeenejä, ja käsittelemällä kudoksia a1,2-fukosidaasilla. NV sitoutuu myös erilaistuneisiin CaCo2-soluihin ja erilaistuneet CaCo2-solut ilmentävät ihmisen histoveriryhmän antigeenejä. Kiinanhamsterin munasarjasolujen (CHO) transfektio a1,2-kytketyllä fukosyylitransferaasi-cDNA:lla mahdollisti NV-viruksen kaltaisten partikkelien (VLP:iden) kiinnittymisen. Sitoutuneet rNV VLP:t sisäistettiin solujen inkuboinnin jälkeen 37 °C:ssa.

Tutkiaksemme edelleen erittäjätilan ja Norwalk-virukselle (NV)-herkkyyden välistä yhteyttä teimme yhteistyötä tohtori Christine Moen kanssa Emory Universityn lääketieteellisestä korkeakoulusta vapaaehtoishaastetutkimuksessa. Tässä tutkimuksessa käytettiin prototyyppiä NV, joka on ensimmäinen noroviruskanta, jota käytettiin ihmisen altistustutkimuksissa. Sylkinäytteet 77 NV:lle altistetulta vapaaehtoiselta testattiin erittäjätilan ja NV:n sitoutumisen suhteen. Viisikymmentäviisi (71 %) 77 vapaaehtoisesta oli sihteeristöä. 55 erittäjästä 34 (62 %) oli infektoitunut NV:llä altistuksen jälkeen ja syljellä 41:stä (75 %) sitoutuneesta NV-rekombinantti-VLP:stä. Yksikään sylkinäytteistä 22 vapaaehtoiselta, joka ei ollut erittävä, ei sitoutunut NV-viruksen kaltaisiin partikkeleihin (VLP), eikä yksikään heistä infektoitunut NV-altistuksen jälkeen; viittaa vahvasti siihen, että herkkyys NV:lle määräytyy ainakin osittain isännän kyvyn sitoa noroviruskantaa.

Äskettäin suoritimme tutkimuksen määrittääksemme, onko muilla noroviruskannoilla samanlainen isäntäspesifisyys, ja olemme laajentaneet sitoutumismallit 7:ään perustuen neljäntoista noroviruksen tutkimiseen. Nämä 7 mallia on luokiteltu kahteen ryhmään niiden vuorovaikutusten mukaan kolmen HBGA:n pääepitoopin (A/B, H ja Lewis) kanssa: A/B:tä sitova ryhmä ja Lewis-sitoutuva ryhmä. A/B-sitoutuvan ryhmän kannat tunnistavat A- ja/tai B- ja H-antigeenit, mutta eivät Lewis-antigeenejä, kun taas Lewis-sitoutuvan ryhmän kannat reagoivat vain Lewis- ja/tai H-antigeeneihin. Tämä luokittelu johti myös Norovirus/HBGA-vuorovaikutuksen malliin, jossa enintään kaksi sitoutumiskohtaa reseptorin sitoutumisrajapinnassa on mukana NV/HBGA-vuorovaikutuksessa. A-, B- ja H-sivuketjut ovat vastuussa A/B:tä sitovien kantojen sitoutumisesta, kun taas Lewis-epitoopit ovat vastuussa Lewis-sitoutumiskannoista. Fylogeneettiset analyysit osoittivat, että kannat, joilla on identtiset tai läheisesti liittyvät sitoutumismallit, pyrkivät klusteroitumaan, mutta molemmissa sitoutumisryhmissä olevia kantoja löytyy sekä genoryhmistä I että II. Tuloksemme viittaavat siihen, että noroviruksilla on laaja kirjo isäntäalueita ja ihmisen HBGA:illa on tärkeä rooli noroviruksen evoluutiossa.

Koska ihmisen noroviruksia ei voida viljellä in vitro tai infektoida eläimiä, on tarpeen suorittaa vapaaehtoisia altistustutkimuksia infektion patobiologian tutkimiseksi. Tutkimus vahvistaa käsitystä, jonka mukaan Noroviruksella on kapea isäntävalikoima, mikä on perustavanlaatuista norovirusten patogeneesissä ja immunologiassa. Lisäksi olemme hiljattain tunnistaneet yli tusina yhdistettä, jotka estävät spesifisesti noroviruksen kiinnittymisen reseptoreihinsa. Ihmisen altistustutkimuksen tulisi myös luoda malli, jota voidaan käyttää näiden uusien yhdisteiden arvioinnissa niiden kyvyn osalta estää viruksen replikaatiota (viruksen vastainen lääke). Lisäksi tutkimuksessamme arvioidaan uudelleen, onko hankittu immuniteetti riippumaton tekijä norovirusinfektioissa, mikä voi tarjota lisätietoa isännän immuniteetista, mikä saattaa olla hyödyllistä rokotteiden kehittämisessä. Lopuksi tutkimus mahdollistaa Norovirus-haastekannan tallentamisen keräämällä tutkittavien ripulista ulosteet. Lisänäytteiden tallentaminen, kuten edellä mainittiin, on kriittistä tulevia kliinisiä tutkimuksia varten, koska virusta ei voida viljellä in vitro ja se on eristettävä ihmisistä, jotka ovat saaneet viruksen.

Erityisessä altistustutkimuksessa käytettäisiin vain yhtä altistuskantaa, ja kaikilla kliinisissä ihmiskokeissa käytetyillä altistuskannoilla olisi erillinen IND- ja FDA-hyväksyntä ennen koehenkilöille antamista.