Wrażliwość ludzkich ochotników z różnymi antygenami histo-krwi z różnymi antygenami grup krwi histo na norowirusa

Norowirusy to jednoniciowe wirusy RNA o dodatnim sensie, które powodują ostre zapalenie żołądka i jelit u ludzi. Prototypowy wirus Norwalk (NV) został zidentyfikowany w dużej epidemii ostrego zapalenia żołądka i jelit w szkole podstawowej w Norwalk w stanie Ohio w 1968 roku. Od tego czasu wiele szczepów zostało opisanych i nazwanych na podstawie miejsc ich pierwszej izolacji. Genetycznie norowirusy należą do jednego z czterech rodzajów należących do rodziny Caliciviridae (CV). Analiza filogenetyczna wykazała, że ​​rodzaj Norovirus jest podzielony na pięć genogrup, a każdą genogrupę można dalej podzielić na klastry genetyczne; zidentyfikowano co najmniej 30 klastrów genetycznych norowirusów.

Norowirusy zostały uznane za najważniejszą przyczynę niebakteryjnych epidemii ostrego zapalenia żołądka i jelit, dotykających osoby w każdym wieku, zarówno w krajach rozwijających się, jak i rozwiniętych. Takie ogniska zwykle mają wysoki wskaźnik ataków i miały miejsce w ośrodkach opieki nad dziećmi, szkołach, restauracjach, obozach letnich, szpitalach, domach opieki, statkach (zarówno cywilnych, jak i wojskowych), a także rozmieszczonych oddziałach wojskowych. Wirusy są wysoce zaraźliwe i są w stanie przetrwać w środowisku przez dłuższy czas. Rozprzestrzeniają się poprzez kontakt z powierzchniami środowiskowymi i przenoszenie się z człowieka na człowieka. Norowirusy zwykle powodują biegunkę o nasileniu od umiarkowanego do ciężkiego, a choroba ta często powoduje obezwładnienie i może być śmiertelna u osób młodych i starszych. Najważniejszym problemem zdrowia publicznego jest to, że norowirusy mogą powodować duże epidemie przenoszone przez wodę i żywność, w wyniku czego wirus jest klasyfikowany jako czynnik czynnika kategorii B.

Norowirusy były również zamieszane w kilka wybuchów wojskowych. „Wirus Desert Shield” (DSV) wyizolowany w oddziałach amerykańskich podczas wojny w Zatoce Perskiej w 1991 roku został następnie zidentyfikowany jako norowirus. Podobnie niedawno zgłoszone „tajemnicze” ataki ostrego zapalenia żołądka i jelit, które dotknęły żołnierzy brytyjskich w Afganistanie, również zostały spowodowane przez Norowirusa. Duże ogniska zapalenia żołądka i jelit związanego z norowirusem są powszechne na statkach marynarki wojennej Stanów Zjednoczonych, podobnie jak te, które miały miejsce na pokładach statków wycieczkowych. Nadzór nad ostrym zapaleniem żołądka i jelit na pokładzie pięciu okrętów bojowych Marynarki Wojennej Stanów Zjednoczonych w latach 1998-1999 wykazał, że wszystkie statki doświadczyły dużych ognisk ostrego zapalenia żołądka i jelit norowirusa podczas ich rozmieszczania na Pacyfiku i Oceanie Indyjskim, po wizytach w portach. Ze względu na szybkie rozprzestrzenianie się choroby wiele departamentów i jednostek na statkach nie mogło funkcjonować w szczytowym momencie zachorowań.

Norowirusy są trudne do zbadania, ponieważ: 1) są bardzo zróżnicowane genetycznie i antygenowo, a wiele szczepów o różnych tożsamościach genetycznych współkrąży w tych samych społecznościach, co sprawia, że ​​diagnoza i kontrola choroby są niezwykle trudne; oraz 2) wirus nie może być hodowany w hodowli komórkowej oraz 3) nie istnieje żaden mały model zwierzęcy do badania norowirusów. Klonowanie molekularne prototypu wirusa Norwalk (NV) w 1990 r. przez jednego ze współbadaczy tego zgłoszenia umożliwiło szybki postęp w badaniu norowirusów i innych rodzajów; jednak wiele kwestii dotyczących infekcji Norowirusem, patogenezy, immunologii i zakresu żywicieli pozostaje nieznanych.

Odkrycie receptorów norowirusów stwarza nowe możliwości oceny patogenezy i epidemiologii norowirusów. Czynnik genetyczny gospodarza związany z infekcją norowirusem został pierwotnie zasugerowany przez wielu badaczy przed klonowaniem norowirusów w latach 90. którzy pozostali zdrowi, byli skupieni w rodzinach, które miały taką samą ekspozycję na norowirusy jak chore rodziny. Ponadto istniejące wcześniej przeciwciała przeciwko NV nie chroniły przed zakażeniem NV, podczas gdy osoby, które miały wysoki poziom przeciwciał przeciwko NV, były bardziej podatne na NV niż osoby, które nie miały przeciwciał. Obserwacje te wskazują, że oprócz odpowiedzi immunologicznej musi istnieć inny czynnik (czynniki), który kontroluje specyficzność gospodarza zakażenia Norowirusem.

Niedawno odkryliśmy, że norowirusy rozpoznają ludzkie antygeny grupowe krwi jako receptory. Używając rekombinowanych białek kapsydu z różnych Norowirusów reprezentujących różne klastry genetyczne, zidentyfikowaliśmy cztery wzorce wiązania Norowirusów z antygenami grup krwi ludzkiej, które są zdefiniowane przez gospodarza Lewisa, sekrecję i grupy krwi ABO. To odkrycie zapewnia nowe podejście do opracowywania strategii kontroli choroby. W szczególności, jeśli norowirusy opierają się na antygenach grup krwi histo na powierzchni komórek nabłonka jelitowego jako receptorach, związek, który hamuje interakcję między wirusem a receptorami, mógłby zostać opracowany jako lek przeciwwirusowy dla norowirusów. Odkrycie to stanowi podstawę niniejszego protokołu, który ma na celu potwierdzenie związku między specyficzną wrażliwością Norowirusa a obecnością swoistego antygenu grupowego krwi histologicznej, a także ustanowienie modelu do oceny przyszłych interwencji (leki i szczepionki).

Specyficzność interakcji NV z ugrupowaniami cukrowymi antygenów grup krwi histologicznej wykazano poprzez swoiste blokowanie wiązania przez mleko kobiece z sekretora, przez przeciwciała monoklonalne swoiste dla antygenów grupowych krwi ludzkiej (HBGA), przez koniugaty syntetycznych oligosacharydów zawierających antygeny wydzielnicze oraz przez traktowanie tkanek fukozydazą α1,2. NV wiąże się również ze zróżnicowanymi komórkami CaCo2, a zróżnicowane komórki CaCo2 wykazują ekspresję ludzkich antygenów grupowych krwi histologicznej. Transfekcja komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) cDNA fukozylotransferazy połączonej wiązaniem 1,2 umożliwiła przyłączenie cząstek wirusopodobnych NV (VLP). Związane VLP rNV internalizowano po inkubacji komórek w 37oC.

Aby dokładniej zbadać związek między stanem wydzielania a podatnością na wirusa Norwalk (NV), współpracowaliśmy z dr Christine Moe z Emory University's School of Medicine w ramach badania prowokacyjnego ochotników. W tym badaniu wykorzystano prototyp NV, pierwszy szczep Norowirusa, który został użyty w badaniach prowokacyjnych u ludzi. Próbki śliny od 77 ochotników poddanych prowokacji NV zbadano pod kątem statusu wydzielania i wiązania NV. Pięćdziesięciu pięciu (71%) z 77 ochotników było sekretorami. Spośród 55 wydzielaczy, 34 (62%) zostało zakażonych NV po prowokacji i ślinie z 41 (75%) związanych rekombinowanych VLP NV. Żadna z próbek śliny od 22 ochotników niewydzielających nie wiązała cząstek wirusopodobnych NV (VLP) i żadna z nich nie została zakażona po prowokacji NV; silnie sugerując, że podatność na NV jest określona przynajmniej częściowo przez zdolność gospodarza do wiązania szczepu norowirusa.

Niedawno przeprowadziliśmy badanie w celu ustalenia, czy inne szczepy norowirusów mają podobny wzorzec specyficzności gospodarza i rozszerzyliśmy wzorce wiązania do 7 na podstawie badania czternastu norowirusów. Siedem wzorców podzielono na dwie grupy w zależności od ich interakcji z trzema głównymi epitopami (A/B, H i Lewis) HBGA: grupa wiążąca A/B i grupa wiążąca Lewisa. Szczepy z grupy wiążącej A/B rozpoznają antygeny A i/lub B i H, ale nie antygeny Lewisa, podczas gdy szczepy z grupy wiążącej Lewisa reagują tylko na antygeny Lewisa i/lub H. Ta klasyfikacja zaowocowała również modelem interakcji Norowirus/HBGA, w którym maksymalnie dwa miejsca wiążące w interfejsie wiązania receptora są zaangażowane w interakcję NV/HBGA. Łańcuchy boczne A, B i H są odpowiedzialne za wiązanie przez szczepy wiążące A/B, podczas gdy epitopy Lewisa są odpowiedzialne za szczepy wiążące Lewisa. Analizy filogenetyczne wykazały, że szczepy o identycznych lub blisko spokrewnionych wzorach wiązania miały tendencję do skupiania się, ale szczepy w obu grupach wiążących można znaleźć w obu genogrupach I i II. Nasze wyniki sugerują, że norowirusy mają szerokie spektrum żywicieli, a ludzkie HBGA odgrywają ważną rolę w ewolucji norowirusów.

Ponieważ ludzkich norowirusów nie można hodować in vitro ani zarażać zwierząt, konieczne jest przeprowadzenie badań prowokacyjnych u ochotników w celu zbadania patobiologii zakażenia. Badanie rozwinie koncepcję, że norowirus ma wąski zakres gospodarzy, co ma fundamentalne znaczenie w patogenezie i immunologii norowirusów. Ponadto ostatnio zidentyfikowaliśmy kilkanaście związków, które specyficznie blokują przyłączanie się norowirusów do ich receptorów. Badanie prowokacyjne u ludzi powinno również stworzyć model, który można wykorzystać do oceny tych nowych związków pod względem ich zdolności do blokowania replikacji wirusa (lek przeciwwirusowy). Ponadto nasze badanie ponownie oceni, czy nabyta odporność jest niezależnym czynnikiem w zakażeniach norowirusem, co może dostarczyć dodatkowych informacji na temat odporności gospodarza, potencjalnie przydatnych w opracowywaniu szczepionek. Wreszcie, badanie pozwoli na bankowanie szczepu prowokacyjnego Norowirusa poprzez zebranie biegunkowych stolców wydalonych przez badanych. Przechowywanie dodatkowych próbek, jak wspomniano powyżej, ma kluczowe znaczenie dla przyszłych badań klinicznych, ponieważ wirus nie może być hodowany in vitro i musi być izolowany od ludzi zakażonych wirusem.

Konkretne badanie prowokacyjne wykorzystywałoby tylko jeden szczep prowokacyjny, a każdy szczep prowokacyjny stosowany w badaniach klinicznych na ludziach miałby osobną aprobatę IND i FDA przed podaniem pacjentom.