Különböző hiszto-vérrel és különböző hiszto-vércsoport-antigénekkel rendelkező önkéntesek érzékenysége a norovírusra

A norovírusok egyszálú, pozitív érzékkel rendelkező RNS-vírusok, amelyek emberben akut gastroenteritist okoznak. A Norwalk-vírus (NV) prototípusát 1968-ban az Ohio állambeli Norwalk egyik általános iskolájában az akut gastroenteritis nagymértékű kitörése során azonosították. Azóta számos törzset leírtak és elneveztek első izolálásuk helye alapján. Genetikailag a norovírusok a Caliciviridae (CV) négy nemzetségének egyikébe tartoznak. A filogenetikai elemzés kimutatta, hogy a Norovirus nemzetség öt genocsoportra oszlik, és mindegyik genocsoport tovább osztható genetikai klaszterekre; legalább 30 norovírus genetikai klasztert azonosítottak.

A norovírusokat az akut gastroenteritisz nem bakteriális járványainak legfontosabb okozójaként ismerték el, amelyek minden korosztályt érintenek, mind a fejlődő, mind a fejlett országokban. Az ilyen járványok általában magas támadási arányúak, és gyermekgondozási központokban, iskolákban, éttermekben, nyári táborokban, kórházakban, idősek otthonában, hajókon (polgári és katonai) és katonai csapatokban fordultak elő. A vírusok rendkívül fertőzőek, és hosszú ideig képesek túlélni a környezetben. A környezeti felületekkel érintkezve és emberről emberre terjedve terjednek. A norovírusok általában közepestől súlyosig terjedő hasmenést okoznak, és a betegség gyakran cselekvőképtelenséget okoz, és halálos lehet fiatalok és idősek számára. A legfontosabb közegészségügyi probléma, hogy a norovírusok nagy víz- és élelmiszer-fertőzéseket okozhatnak, aminek következtében a vírus a B kategóriás kórokozók közé sorolható.

A norovírusok több katonai járványban is szerepet kaptak. Az 1991-es Öbölháborúban az amerikai csapatokban izolált "Desert Shield vírust" (DSV) ezt követően norovírusként azonosították. Hasonlóképpen, a közelmúltban jelentett "titokzatos" heveny gyomor-bélgyulladásos rohamokat, amelyek az Afganisztánban tartózkodó brit csapatokat érintették, szintén egy norovírus okozta. Az amerikai haditengerészet hajóin gyakoriak a norovírussal összefüggő gyomor-bélgyulladás nagy kitörései, hasonlóan a tengerjáró hajókon. Az amerikai haditengerészet öt harci hajójának fedélzetén 1998-1999-ben végzett akut gyomor-bélhurut megfigyelése azt mutatta, hogy a kikötői látogatásokat követően valamennyi hajón a Csendes-óceánon és az Indiai-óceánon való bevetésük során nagymértékű Norovírus-akut gyomor-bélhurut járványt észleltek. A betegség gyors terjedése miatt a hajók fedélzetén lévő számos részleg és egység nem tudott működni a járványok csúcspontjában.

A norovírusokat nehéz tanulmányozni, mert: 1) genetikailag és antigénikusan nagyon változatosak, és több, eltérő genetikai identitással rendelkező törzs kering együtt ugyanazon közösségekben, ami rendkívül megnehezíti a diagnózist és a betegségek leküzdését; és 2) a vírus nem tenyészthető sejttenyészetben, és 3) nem létezik kisállat modell a norovírusok tanulmányozására. A Norwalk Virus (NV) prototípusának 1990-ben végzett molekuláris klónozása az alkalmazás egyik társkutatója által gyors előrehaladást tett lehetővé a norovírusok és más nemzetségek tanulmányozásában; a norovírus fertőzéssel, patogenezissel, immunológiával és gazdaszervezetekkel kapcsolatos számos kérdés azonban ismeretlen marad.

A norovírus receptorok felfedezése új lehetőségeket kínál a norovírusok patogenezisének és epidemiológiájának értékelésére. A norovírusfertőzéssel járó gazdagenetikai faktort eredetileg sok kutató javasolta a norovírusok klónozása előtt, az 1990-es években, mivel a norovírusok elleni antitestekkel nem rendelkező egyének körülbelül 20-30%-a soha nem fertőződött meg NV-vel való fertőzést követően, és járványok esetén az egyének akik egészségesek maradtak, olyan családokba csoportosultak, amelyek ugyanolyan mértékben voltak kitéve a norovírusoknak, mint a beteg családok. Ezenkívül a már meglévő NV elleni antitestek nem nyújtottak védelmet az NV-fertőzéssel szemben, míg azok az egyének, akiknél magas volt az NV elleni antitestek szintje, érzékenyebbek voltak az NV-re, mint azok, akik nem rendelkeztek antitestekkel. Ezek a megfigyelések azt mutatják, hogy az immunválaszokon kívül más tényező(k)nek is kell lenniük, amelyek szabályozzák a norovírus fertőzés gazdaspecifikusságát.

Nemrég felfedeztük, hogy a norovírusok receptorként ismerik fel a humán hiszto-vércsoport-antigéneket. Különböző genetikai klasztereket képviselő norovírusokból származó rekombináns kapszid fehérjék felhasználásával négy norovírus kötődési mintát azonosítottunk a humán hiszto-vércsoport antigénekhez, amelyeket a gazda Lewis, a szekréciós és az ABO vércsoport határoz meg. Ez a megállapítás új megközelítést kínál a betegség leküzdésére szolgáló stratégiák kidolgozásához. Pontosabban, ha a norovírusok a bélhámsejtek felszínén található hiszto-vércsoport-antigénekre támaszkodnak receptorként, akkor a vírus és a receptorok közötti kölcsönhatást gátoló vegyületet vírusellenes gyógyszerként lehetne kifejleszteni a norovírusok számára. Ez a megállapítás képezi az alapját ennek a protokollnak, amely megkísérli megerősíteni a kapcsolatot a specifikus norovírus érzékenység és a specifikus hiszto-vércsoport antigén jelenléte között, valamint modellt hoz létre a jövőbeni beavatkozások (gyógyszerek és vakcinák) értékeléséhez.

A hiszto-vércsoport-antigének cukorrészeivel való NV-kölcsönhatás specifitását az emberi tej szekrétortól való kötődésének specifikus blokkolása, a szekréciós humán vércsoport-antigénekre (HBGA-k) specifikus monoklonális antitestek, szintetikus oligoszacharidkonjugátumok mutatták ki. szekréciós antigéneket tartalmaz, és a szöveteket a1,2-fukozidázzal kezeljük. Az NV a differenciált CaCo2 sejtekhez is kötődik, és a differenciált CaCo2 sejtek humán hiszto-vércsoport antigéneket expresszálnak. Kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtek transzfekciója a1,2-kapcsolt fukozil-transzferáz cDNS-sel lehetővé tette az NV vírusszerű részecskék (VLP-k) kapcsolódását. A megkötött rNV VLP-ket a sejtek 37 oC-on történő inkubálása után internalizáltuk.

A szekréciós státusz és a Norwalk vírusra (NV) szembeni érzékenység közötti összefüggés további vizsgálata érdekében Dr. Christine Moe-val együttműködtünk az Emory Egyetem Orvostudományi Karán egy önkéntes kihívást jelentő vizsgálatban. Ebben a tanulmányban az NV prototípust alkalmazták, az első norovírus törzset, amelyet emberi kihívásokkal kapcsolatos vizsgálatokhoz használtak. 77 NV-vel fertőzött önkéntes nyálmintáit tesztelték szekréciós státuszra és NV-kötődésre. A 77 önkéntes közül 55 (71%) szekréciós volt. Az 55 szekretor közül 34 (62%) fertőzött NV-vel a fertőzést követően, és 41 (75%) kötött NV rekombináns VLP-ből származó nyál. A 22 nem szekretáló önkéntes nyálmintája egyike sem kötött NV vírusszerű részecskéket (VLP), és egyikük sem fertőződött meg az NV-fertőzést követően; erősen arra utal, hogy az NV-re való fogékonyságot legalább részben a gazdaszervezet azon képessége határozza meg, hogy megköti a norovírus törzset.

A közelmúltban egy tanulmányt végeztünk annak meghatározására, hogy a Norovírusok más törzsei hasonló gazda-specifikus mintázatot mutatnak-e, és tizennégy norovírus vizsgálata alapján 7-re kiterjesztettük a kötődési mintázatot. A 7 mintázatot két csoportba sorolták a HBGA három fő epitópjával (A/B, H és Lewis) való kölcsönhatásuk szerint: az A/B-kötő csoport és a Lewis-kötő csoport. Az A/B kötő csoportba tartozó törzsek felismerik az A és/vagy B és H antigéneket, de a Lewis antigéneket nem, míg a Lewis-kötő csoportba tartozó törzsek csak a Lewis és/vagy H antigénekre reagálnak. Ez a besorolás a Norovírus/HBGA kölcsönhatás modelljét is eredményezte, amelyben egy receptorkötő interfészen belül legfeljebb két kötőhely vesz részt az NV/HBGA kölcsönhatásban. Az A, B és H oldalláncok felelősek az A/B kötő törzsek kötődéséért, míg a Lewis epitópok a Lewis kötő törzsekért. A filogenetikai analízisek azt mutatták, hogy az azonos vagy közeli kötődési mintázattal rendelkező törzsek csoportosultak, de mindkét kötőcsoportba tartozó törzsek mind az I., mind a II. genocsoportban megtalálhatók. Eredményeink azt sugallják, hogy a norovírusok széles spektrumú gazdaszervezettel rendelkeznek, és a humán HBGA-k fontos szerepet játszanak a norovírus evolúciójában.

Mivel a humán norovírusok nem tenyészthetők in vitro, és nem fertőzhetők meg állatokkal, a fertőzés patobiológiájának tanulmányozása érdekében emberi önkéntesekkel végzett provokációs vizsgálatokat kell végezni. A tanulmány tovább erősíti azt az elképzelést, hogy a norovírus szűk gazdakörrel rendelkezik, ami alapvető a norovírusok patogenezisében és immunológiájában. Ezenkívül a közelmúltban több mint egy tucat olyan vegyületet azonosítottunk, amelyek specifikusan blokkolják a norovírus kötődését a receptoraikhoz. A humán kihívást jelentő vizsgálatnak egy olyan modellt is fel kell állítania, amely felhasználható ezen új vegyületek vírusreplikációt blokkoló képességének értékelésére (vírusellenes gyógyszer). Vizsgálatunk továbbá újraértékeli, hogy a megszerzett immunitás független tényező-e a norovírusfertőzésekben, ami további információkkal szolgálhat a gazdaszervezet immunitásával kapcsolatban, ami potenciálisan hasznos lehet a vakcinafejlesztésben. Végezetül, a vizsgálat lehetővé teszi a Norovirus provokatív törzs bankba foglalását azáltal, hogy összegyűjti a vizsgálati alanyok hasmenéses székletét. A további minták bankba foglalása, amint azt fentebb említettük, kritikus fontosságú a jövőbeli klinikai vizsgálatokhoz, mivel a vírust nem lehet in vitro tenyészteni, és a vírussal fertőzött emberektől kell izolálni.

Egy specifikus provokációs vizsgálat csak egy provokatív törzset használna, és a humán klinikai vizsgálatokban használt provokatív törzsek külön IND- és FDA-jóváhagyással rendelkeznének az alanyoknak való beadás előtt.