Anfälligkeit menschlicher Freiwilliger mit unterschiedlichem Histo-Blut mit unterschiedlichen Histo-Blutgruppen-Antigenen gegenüber Norovirus

Noroviren sind einzelsträngige RNA-Viren mit positivem Sinn, die beim Menschen eine akute Gastroenteritis verursachen. Der Prototyp des Norwalk-Virus (NV) wurde 1968 bei einem großen Ausbruch akuter Gastroenteritis in einer Grundschule in Norwalk, Ohio, identifiziert. Seitdem wurden viele Stämme beschrieben und nach den Orten ihrer ersten Isolierung benannt. Genetisch gehören Noroviren zu einer von vier Gattungen innerhalb der Caliciviridae (CV). Die phylogenetische Analyse hat gezeigt, dass die Gattung Norovirus in fünf Genogruppen unterteilt ist und jede Genogruppe weiter in genetische Cluster unterteilt werden kann; Mindestens 30 genetische Cluster von Noroviren wurden identifiziert.

Noroviren gelten als die wichtigste Ursache für nicht-bakterielle Epidemien der akuten Gastroenteritis, die sowohl in Entwicklungs- als auch in Industrieländern Menschen jeden Alters betreffen. Solche Ausbrüche haben in der Regel hohe Angriffsraten und sind in Kindertagesstätten, Schulen, Restaurants, Sommercamps, Krankenhäusern, Pflegeheimen, Schiffen (sowohl zivil als auch militärisch) sowie bei eingesetzten Militärtruppen aufgetreten. Die Viren sind hoch ansteckend und können in der Umwelt längere Zeit überleben. Sie werden durch Kontakt mit Oberflächen in der Umgebung und Übertragung von Mensch zu Mensch verbreitet. Noroviren verursachen normalerweise mittelschweren bis schweren Durchfall, und die Krankheit ist oft handlungsunfähig und kann bei jungen und älteren Menschen tödlich sein. Die wichtigste Sorge für die öffentliche Gesundheit besteht darin, dass Noroviren große wasser- und lebensmittelbedingte Ausbrüche verursachen können, was dazu führt, dass das Virus als Erreger der Kategorie B eingestuft wird.

Noroviren wurden auch in mehrere militärische Ausbrüche verwickelt. Das im Golfkrieg 1991 bei US-Truppen isolierte „Desert Shield Virus“ (DSV) wurde später als Norovirus identifiziert. In ähnlicher Weise wurden die kürzlich gemeldeten "mysteriösen" Anfälle von akuter Gastroenteritis, die die britischen Truppen in Afghanistan betrafen, ebenfalls durch ein Norovirus verursacht. Große Ausbrüche von Norovirus-assoziierter Gastroenteritis sind auf Schiffen der US Navy üblich, ähnlich denen, die an Bord von Kreuzfahrtschiffen auftraten. Die Überwachung der akuten Gastroenteritis an Bord von fünf Kampfschiffen der US Navy in den Jahren 1998-1999 zeigte, dass alle Schiffe während ihres Einsatzes im Pazifik und im Indischen Ozean nach Hafenbesuchen große Ausbrüche von akuter Gastroenteritis durch das Norovirus erlebten. Aufgrund der schnellen Ausbreitung der Krankheit waren viele Abteilungen und Einheiten an Bord der Schiffe während des Höhepunkts der Ausbrüche nicht funktionsfähig.

Noroviren sind schwierig zu untersuchen, weil: 1) sie genetisch und antigenisch sehr vielfältig sind und mehrere Stämme mit unterschiedlichen genetischen Identitäten in denselben Gemeinschaften zirkulieren, was die Diagnose und Krankheitskontrolle extrem schwierig macht; und 2) das Virus kann nicht in Zellkultur kultiviert werden und 3) es gibt kein Kleintiermodell zum Studium von Noroviren. Das molekulare Klonen des Prototyps des Norwalk-Virus (NV) im Jahr 1990 durch einen der Mitforscher dieser Anmeldung hat schnelle Fortschritte bei der Untersuchung von Noroviren und anderen Gattungen ermöglicht; Viele Fragen zur Norovirus-Infektion, Pathogenese, Immunologie und Wirtsspektrum bleiben jedoch unbekannt.

Die Entdeckung von Norovirus-Rezeptoren bietet neue Möglichkeiten zur Bewertung der Pathogenese und Epidemiologie von Noroviren. Ein genetischer Wirtsfaktor, der eine Norovirus-Infektion beinhaltet, wurde ursprünglich von vielen Forschern vor dem Klonen von Noroviren in den 1990er Jahren vorgeschlagen, da etwa 20-30 % der Personen, die keine Antikörper gegen Noroviren hatten, nach einer Herausforderung mit NV nie infiziert wurden, und bei Ausbrüchen Personen die gesund blieben, wurden in Familien gehäuft, die der gleichen Exposition gegenüber Noroviren ausgesetzt waren wie die kranken Familien. Darüber hinaus schützten bereits vorhandene Antikörper gegen NV nicht vor einer NV-Infektion, während Personen mit hohen Antikörperspiegeln gegen NV anfälliger für NV waren als Personen ohne Antikörper. Diese Beobachtungen weisen darauf hin, dass es zusätzlich zu den Immunantworten noch einen oder mehrere weitere Faktoren geben muss, die die Wirtsspezifität der Norovirus-Infektion kontrollieren.

Wir haben kürzlich entdeckt, dass Noroviren menschliche Histo-Blutgruppen-Antigene als Rezeptoren erkennen. Unter Verwendung rekombinanter Kapsidproteine ​​aus verschiedenen Noroviren, die unterschiedliche genetische Cluster darstellen, haben wir vier Bindungsmuster von Noroviren an humane Histo-Blutgruppen-Antigene identifiziert, die durch die Wirts-Lewis-, Sekretor- und ABO-Blutgruppen definiert sind. Diese Erkenntnis bietet einen neuen Ansatz zur Entwicklung von Strategien zur Bekämpfung der Krankheit. Wenn sich Noroviren insbesondere auf die Histo-Blutgruppenantigene auf den Oberflächen der Darmepithelzellen als Rezeptoren verlassen, könnte eine Verbindung, die die Wechselwirkung zwischen dem Virus und den Rezeptoren hemmt, als antivirales Medikament für Noroviren entwickelt werden. Dieser Befund bildet die Grundlage für dieses Protokoll, das darauf abzielt, die Beziehung zwischen der spezifischen Norovirus-Empfindlichkeit und dem Vorhandensein spezifischer Histo-Blutgruppen-Antigene zu bestätigen und ein Modell zur Bewertung zukünftiger Interventionen (Medikamente und Impfstoffe) zu etablieren.

Die Spezifität der NV-Wechselwirkung mit den Zuckereinheiten von Histo-Blutgruppen-Antigenen wurde durch spezifische Blockierung der Bindung durch menschliche Milch eines Sekretors, durch monoklonale Antikörper, die spezifisch für sekretorische menschliche Blutgruppen-Antigene (HBGAs) sind, durch synthetische Oligosaccharid-Konjugate gezeigt die sekretorische Antigene enthalten, und durch Behandlung der Gewebe mit a1,2-Fucosidase. NV bindet auch an differenzierte CaCo2-Zellen und differenzierte CaCo2-Zellen exprimieren menschliche Histoblutgruppen-Antigene. Die Transfektion von Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) mit einer a1,2-verknüpften Fucosyltransferase-cDNA ermöglichte die Anheftung von NV-Virus-ähnlichen Partikeln (VLPs). Die gebundenen rNV-VLPs wurden nach Inkubation der Zellen bei 37°C internalisiert.

Um den Zusammenhang zwischen Sekretorstatus und Anfälligkeit für das Norwalk-Virus (NV) weiter zu untersuchen, haben wir mit Dr. Christine Moe von der School of Medicine der Emory University an einer Provokationsstudie mit Freiwilligen zusammengearbeitet. Diese Studie verwendete den Prototyp NV, den ersten Norovirus-Stamm, der für Human-Challenge-Studien verwendet wurde. Speichelproben von 77 NV-belasteten Freiwilligen wurden auf Sekretorstatus und NV-Bindung getestet. Fünfundfünfzig (71 %) der 77 Freiwilligen waren Sekretoren. Unter den 55 Sekretoren wurden 34 (62 %) nach der Herausforderung mit NV infiziert und Speichel von 41 (75 %) band rekombinante NV-VLPs. Keine der Speichelproben der 22 Nicht-Sekretor-Freiwilligen band NV-Virus-ähnliche Partikel (VLPs) und keiner von ihnen wurde nach der NV-Provokation infiziert; was stark darauf hindeutet, dass die Anfälligkeit für NV zumindest teilweise durch die Fähigkeit des Wirts bestimmt wird, den Norovirus-Stamm zu binden.

Kürzlich führten wir eine Studie durch, um festzustellen, ob andere Stämme von Noroviren ein ähnliches Muster der Wirtsspezifität aufweisen, und haben die Bindungsmuster auf der Grundlage der Untersuchung von vierzehn Noroviren auf 7 erweitert. Die 7 Muster wurden gemäß ihren Wechselwirkungen mit drei Hauptepitopen (A/B, H und Lewis) von HBGAs in zwei Gruppen eingeteilt: die A/B-Bindungsgruppe und die Lewis-Bindungsgruppe. Stämme in der A/B-Bindungsgruppe erkennen die A- und/oder B- und H-Antigene, aber nicht die Lewis-Antigene, während Stämme in der Lewis-Bindungsgruppe nur auf die Lewis- und/oder H-Antigene reagieren. Diese Klassifizierung führte auch zu einem Modell der Norovirus/HBGA-Interaktion, bei dem maximal zwei Bindungsstellen innerhalb einer Rezeptorbindungsschnittstelle an der NV/HBGA-Interaktion beteiligt sind. Die A-, B- und H-Seitenketten sind für die Bindung durch die A/B-bindenden Stämme verantwortlich, während die Lewis-Epitope für die Lewis-bindenden Stämme verantwortlich sind. Phylogenetische Analysen zeigten, dass Stämme mit identischen oder eng verwandten Bindungsmustern dazu neigten, sich zu gruppieren, aber Stämme in beiden Bindungsgruppen können in beiden Genogruppen I und II gefunden werden. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Noroviren ein breites Wirtsspektrum haben und menschliche HBGAs eine wichtige Rolle in der Norovirus-Evolution spielen.

Da humane Noroviren nicht in vitro kultiviert oder Tiere infiziert werden können, ist es notwendig, Provokationsstudien mit menschlichen Freiwilligen durchzuführen, um die Pathobiologie der Infektion zu untersuchen. Die Studie wird das Konzept fördern, dass Norovirus ein enges Wirtsspektrum hat, das für die Pathogenese und Immunologie von Noroviren von grundlegender Bedeutung ist. Darüber hinaus haben wir kürzlich mehr als ein Dutzend Verbindungen identifiziert, die spezifisch die Norovirus-Anheftung an ihre Rezeptoren blockieren. Die Human-Challenge-Studie sollte auch ein Modell etablieren, das bei der Bewertung dieser neuen Verbindungen im Hinblick auf ihre Fähigkeit zur Blockierung der Virusreplikation (antivirales Medikament) verwendet werden kann. Darüber hinaus wird unsere Studie neu bewerten, ob die erworbene Immunität ein unabhängiger Faktor bei Norovirus-Infektionen ist, was zusätzliche Informationen über die Wirtsimmunität liefern könnte, die möglicherweise für die Impfstoffentwicklung nützlich sind. Schließlich wird die Studie das Banking des Norovirus-Challenge-Stammes ermöglichen, indem die von den Studienteilnehmern ausgeschiedenen Durchfallstühle gesammelt werden. Die Einlagerung zusätzlicher Proben ist, wie oben erwähnt, für zukünftige klinische Studien von entscheidender Bedeutung, da das Virus nicht in vitro kultiviert werden kann und von mit dem Virus infizierten Menschen isoliert werden muss.

Eine spezifische Provokationsstudie würde nur einen Provokationsstamm verwenden, und jeder Provokationsstamm, der in klinischen Studien am Menschen verwendet wird, hätte vor der Verabreichung an Probanden eine separate IND- und FDA-Zulassung.