Suscetibilidade de voluntários humanos com diferentes histo-sangues com diferentes antígenos de grupos histo-sangues ao norovírus

Os norovírus são vírus de RNA de sentido positivo de fita simples que causam gastroenterite aguda em humanos. O protótipo do vírus Norwalk (NV) foi identificado em um grande surto de gastroenterite aguda em uma escola primária em Norwalk, Ohio, em 1968. Desde então, muitas cepas foram descritas e nomeadas pelos locais de seu primeiro isolamento. Geneticamente, os norovírus pertencem a um dos quatro gêneros dentro de Caliciviridae (CV). A análise filogenética mostrou que o gênero Norovirus é dividido em cinco genogrupos e cada genogrupo pode ser dividido em grupos genéticos; pelo menos 30 agrupamentos genéticos de Norovírus foram identificados.

Os norovírus têm sido reconhecidos como a causa mais importante de epidemias não bacterianas de gastroenterite aguda, afetando indivíduos de todas as idades, tanto em países desenvolvidos quanto em desenvolvimento. Esses surtos geralmente têm altas taxas de ataque e ocorreram em creches, escolas, restaurantes, acampamentos de verão, hospitais, lares de idosos, navios (civis e militares), bem como tropas militares destacadas. Os vírus são altamente contagiosos e são capazes de sobreviver no ambiente por longos períodos de tempo. Eles são espalhados pelo contato com superfícies ambientais e transmissão de pessoa para pessoa. Os norovírus normalmente causam diarreia moderada a grave e a doença é frequentemente incapacitante e pode ser fatal em jovens e idosos. A preocupação de saúde pública mais importante é que os norovírus podem causar grandes surtos de origem hídrica e alimentar, resultando na classificação do vírus como um agente de categoria B.

Os norovírus também foram implicados em vários surtos militares. O "vírus Desert Shield" (DSV) isolado nas tropas dos EUA na Guerra do Golfo de 1991 foi posteriormente identificado como um Norovírus. Da mesma forma, os ataques "misteriosos" recentemente relatados de gastroenterite aguda afetando as tropas britânicas no Afeganistão também foram causados ​​por um Norovírus. Grandes surtos de gastroenterite associada a norovírus são comuns em navios da Marinha dos EUA, semelhantes aos que ocorreram a bordo de navios de cruzeiro. A vigilância de gastroenterite aguda a bordo de cinco navios de combate da Marinha dos EUA em 1998-1999 mostrou que todos os navios experimentaram grandes surtos de gastroenterite aguda por Norovírus durante sua implantação nos oceanos Pacífico e Índico, após visitas a portos. Devido à rápida disseminação da doença, muitos departamentos e unidades a bordo dos navios não puderam funcionar durante o pico dos surtos.

Os norovírus são difíceis de estudar porque: 1) são geneticamente e antigenicamente altamente diversos e múltiplas cepas com identidades genéticas distintas co-circulam nas mesmas comunidades, tornando o diagnóstico e o controle da doença extremamente difíceis; e 2) o vírus não pode ser cultivado em cultura celular e 3) não existe nenhum modelo animal pequeno para estudar Norovírus. A clonagem molecular do protótipo Norwalk Virus (NV) em 1990 por um dos co-investigadores desta aplicação permitiu um rápido progresso no estudo de Noroviruses e outros gêneros; no entanto, muitas questões sobre infecção por Norovírus, patogênese, imunologia e gama de hospedeiros permanecem desconhecidas.

A descoberta de receptores de norovírus oferece novas oportunidades para avaliar a patogênese e a epidemiologia dos norovírus. Um fator genético do hospedeiro envolvendo infecção por Norovírus foi originalmente sugerido por muitos pesquisadores antes da clonagem de Norovírus na década de 1990, porque cerca de 20-30% dos indivíduos que não tinham anticorpos contra Norovírus nunca foram infectados após um desafio com NV e, em surtos, indivíduos que permaneceram saudáveis ​​foram agrupados em famílias que tiveram a mesma exposição aos norovírus que as famílias doentes. Além disso, os anticorpos pré-existentes contra NV não eram protetores contra a infecção por NV, enquanto os indivíduos que tinham altos níveis de anticorpos contra NV eram mais suscetíveis a NV do que os indivíduos que não tinham os anticorpos. Essas observações indicam que, além das respostas imunes, deve haver outro(s) fator(es) que controlam a especificidade do hospedeiro da infecção por Norovírus.

Descobrimos recentemente que os norovírus reconhecem os antígenos do grupo histo-sangue humano como receptores. Usando proteínas recombinantes do capsídeo de diferentes norovírus representando diferentes clusters genéticos, identificamos quatro padrões de ligação de norovírus a antígenos do grupo histo-sangue humano, que são definidos pelos tipos sanguíneos hospedeiro Lewis, secretor e ABO. Esta descoberta fornece uma nova abordagem para desenvolver estratégias para controlar a doença. Especificamente, se os norovírus dependem dos antígenos do grupo histo-sangue nas superfícies das células epiteliais intestinais como receptores, um composto que inibe a interação entre o vírus e os receptores pode ser desenvolvido como uma droga antiviral para os norovírus. Esta descoberta fornece a base para este protocolo que busca confirmar a relação entre a suscetibilidade específica do Norovírus e a presença de antígenos de grupos sanguíneos específicos, bem como estabelecer um modelo para avaliar intervenções futuras (medicamentos e vacinas).

A especificidade da interação NV com as porções de açúcar de antígenos de grupos sanguíneos histopatológicos foi demonstrada pelo bloqueio específico da ligação do leite humano de um secretor, por anticorpos monoclonais específicos para antígenos secretores de grupos sanguíneos humanos (HBGAs), por conjugados de oligossacarídeos sintéticos contendo antigénios secretores e por tratamento dos tecidos com a1,2 fucosidase. NV também se liga a células diferenciadas de CaCo2 e células diferenciadas de CaCo2 expressam antígenos do grupo histo-sangue humano. A transfecção de células de ovário de hamster chinês (CHO) com um cDNA de fucosil-transferase ligada a a1,2 permitiu a ligação de partículas semelhantes a vírus NV (VLPs). As VLPs de rNV ligadas foram internalizadas após a incubação das células a 37oC.

Para investigar mais a fundo a associação entre o status secretor e a suscetibilidade ao vírus Norwalk (NV), colaboramos com a Dra. Christine Moe da Escola de Medicina da Universidade Emory em um estudo de desafio voluntário. Este estudo utilizou o protótipo NV, a primeira cepa de Norovírus a ser usada para estudos de desafio humano. Amostras de saliva de 77 voluntários desafiados com NV foram testadas quanto ao status secretor e à ligação de NV. Cinquenta e cinco (71%) dos 77 voluntários eram secretores. Entre os 55 secretores, 34 (62%) foram infectados com NV após desafio e saliva de 41 (75%) VLPs recombinantes de NV ligados. Nenhuma das amostras de saliva dos 22 voluntários não secretores se ligou a partículas semelhantes a vírus NV (VLPs) e nenhuma delas foi infectada após o desafio NV; sugerindo fortemente que a suscetibilidade a NV é determinada, pelo menos em parte, pela capacidade do hospedeiro de se ligar à cepa de norovírus.

Mais recentemente, realizamos um estudo para determinar se outras cepas de norovírus têm um padrão semelhante de especificidade do hospedeiro e estendemos os padrões de ligação para 7 com base no exame de quatorze norovírus. Os 7 padrões foram classificados em dois grupos de acordo com suas interações com três epítopos principais (A/B, H e Lewis) de HBGAs: o grupo de ligação A/B e o grupo de ligação de Lewis. As cepas do grupo de ligação A/B reconhecem os antígenos A e/ou B e H, mas não os antígenos Lewis, enquanto as cepas do grupo de ligação Lewis reagem apenas aos antígenos Lewis e/ou H. Essa classificação também resultou em um modelo de interação Norovírus/HBGA, em que no máximo dois sítios de ligação dentro de uma interface de ligação ao receptor estão envolvidos na interação NV/HBGA. As cadeias laterais A, B e H são responsáveis ​​pela ligação das cepas de ligação A/B, enquanto os epítopos de Lewis são responsáveis ​​pelas cepas de ligação de Lewis. Análises filogenéticas mostraram que cepas com padrões de ligação idênticos ou intimamente relacionados tendem a ser agrupadas, mas cepas em ambos os grupos de ligação podem ser encontradas em ambos os genogrupos I e II. Nossos resultados sugerem que os norovírus têm um amplo espectro de hospedeiros e os HBGAs humanos desempenham um papel importante na evolução do norovírus.

Uma vez que os norovírus humanos não podem ser cultivados in vitro ou infectar animais, é necessário realizar estudos de desafio humano voluntário para estudar a patobiologia da infecção. O estudo aprofundará o conceito de que o Norovírus tem uma gama estreita de hospedeiros, o que é fundamental na patogênese e imunologia dos Norovírus. Além disso, identificamos recentemente mais de uma dúzia de compostos que bloqueiam especificamente a ligação do Norovírus aos seus receptores. O estudo de provocação humana também deve estabelecer um modelo que possa ser utilizado na avaliação desses novos compostos quanto à sua capacidade de bloquear a replicação do vírus (droga antiviral). Além disso, nosso estudo reavaliará se a imunidade adquirida é um fator independente nas infecções por Norovírus, o que pode fornecer informações adicionais sobre a imunidade do hospedeiro potencialmente útil no desenvolvimento de vacinas. Finalmente, o estudo permitirá o armazenamento da cepa de desafio do Norovírus coletando as fezes diarréicas transmitidas pelos sujeitos do estudo. O armazenamento de amostras adicionais, conforme mencionado acima, é crítico para futuros ensaios clínicos porque o vírus não pode ser cultivado in vitro e deve ser isolado de humanos infectados com o vírus.

Um estudo de desafio específico usaria apenas uma cepa de desafio e qualquer cepa de desafio usada em ensaios clínicos humanos teria uma aprovação separada do IND e do FDA antes da administração aos indivíduos.