Mottakelighet av menneskelige frivillige med forskjellig histo-blod med ulike histo-blodgruppeantigener for Norovirus

Norovirus er enkeltstrengede RNA-virus med positiv sans som forårsaker akutt gastroenteritt hos mennesker. Prototypen Norwalk-virus (NV) ble identifisert i et stort utbrudd av akutt gastroenteritt på en barneskole i Norwalk, Ohio, i 1968. Siden den gang har mange stammer blitt beskrevet og navngitt etter plasseringen av deres første isolasjon. Genetisk sett tilhører Norovirus en av fire slekter innenfor Caliciviridae (CV). Fylogenetisk analyse har vist at Norovirus-slekten er delt inn i fem genogrupper og hver genogruppe kan videre deles inn i genetiske klynger; minst 30 genetiske klynger av Norovirus er identifisert.

Norovirus har blitt anerkjent som den viktigste årsaken til ikke-bakterielle epidemier av akutt gastroenteritt, som påvirker individer i alle aldre, både i utviklingsland og i utviklede land. Slike utbrudd har vanligvis høye angrepsrater og har forekommet i barnevernsentre, skoler, restauranter, sommerleirer, sykehus, sykehjem, skip (både sivile og militære) samt utplasserte militære tropper. Virusene er svært smittsomme og er i stand til å overleve i miljøet i lengre perioder. De spres ved kontakt med miljøoverflater og overføring fra person til person. Norovirus forårsaker normalt moderat til alvorlig diaré, og sykdommen er ofte invalidiserende og kan være dødelig hos unge og eldre. Det viktigste folkehelseproblemet er at Norovirus kan forårsake store vann- og matbårne utbrudd, noe som resulterer i at viruset blir klassifisert som et kategori B-middel.

Norovirus har også vært involvert i flere militære utbrudd. "Desert Shield-viruset" (DSV) isolert i amerikanske tropper i Gulf-krigen i 1991 ble deretter identifisert som et Norovirus. Tilsvarende ble de nylig rapporterte "mystiske" angrepene av akutt gastroenteritt som påvirker de britiske troppene i Afghanistan også forårsaket av et Norovirus. Store utbrudd av Norovirus-assosiert gastroenteritt er vanlig på US Navy-skip, lik de som skjedde om bord på cruiseskipslinjer. Overvåking av akutt gastroenteritt om bord på fem amerikanske marines kampskip i 1998-1999 viste at alle skipene opplevde store utbrudd av Norovirus akutt gastroenteritt under utplasseringen i Stillehavet og Det indiske hav, etter havnebesøk. På grunn av den raske spredningen av sykdommen var mange avdelinger og enheter om bord på skipene ikke i stand til å fungere under toppen av utbruddene.

Norovirus er vanskelig å studere fordi: 1) de er genetisk og antigenisk svært forskjellige og flere stammer med distinkte genetiske identiteter samsirkulerer i de samme samfunnene, noe som gjør diagnose og sykdomskontroll ekstremt vanskelig; og 2) viruset kan ikke dyrkes i cellekultur og 3) ingen liten dyremodell for å studere norovirus eksisterer. Den molekylære kloningen av prototypen Norwalk Virus (NV) i 1990 av en av medforskerne av denne applikasjonen har muliggjort raske fremskritt i å studere norovirus og andre slekter; Imidlertid er mange problemer med Norovirusinfeksjon, patogenese, immunologi og vertsområde fortsatt ukjente.

Oppdagelsen av Norovirus-reseptorer gir nye muligheter for å evaluere patogenesen og epidemiologien til Norovirus. En vertsgenetisk faktor som involverer norovirusinfeksjon ble opprinnelig foreslått av mange forskere før kloningen av norovirus på 1990-tallet fordi omtrent 20-30 % av individer som ikke hadde antistoffer mot norovirus aldri ble infisert etter en utfordring med NV, og i utbrudd, individer som forble friske ble gruppert i familier som hadde samme eksponering for Norovirus som de syke familiene. Videre var ikke eksisterende antistoffer mot NV beskyttende mot NV-infeksjon, mens individer som hadde høye nivåer av antistoffer mot NV var mer mottakelige for NV enn individer som ikke hadde antistoffene. Disse observasjonene indikerer at det, i tillegg til immunresponser, må være en annen faktor(er) som kontrollerer vertsspesifisiteten til Norovirusinfeksjon.

Vi oppdaget nylig at Norovirus gjenkjenner humane histo-blodgruppeantigener som reseptorer. Ved å bruke rekombinante kapsidproteiner fra forskjellige Norovirus som representerer forskjellige genetiske klynger, har vi identifisert fire bindingsmønstre av Norovirus til humane histo-blodgruppeantigener, som er definert av verten Lewis, sekretor og ABO blodtyper. Dette funnet gir en ny tilnærming til å utvikle strategier for å kontrollere sykdommen. Spesifikt, hvis Norovirus er avhengig av histo-blodgruppeantigener på overflaten av tarmepitelcellene som reseptorer, kan en forbindelse som hemmer interaksjonen mellom viruset og reseptorene utvikles som et antiviralt medikament for Norovirus. Dette funnet gir grunnlaget for denne protokollen som søker å bekrefte forholdet mellom spesifikk Norovirus-mottakelighet og spesifikk histo-blodgruppeantigen-tilstedeværelse, samt etablere en modell for å evaluere fremtidige intervensjoner (legemidler og vaksiner).

Spesifisiteten til NV-interaksjonen med sukkerdelene til histo-blodgruppeantigener ble vist ved spesifikk blokkering av bindingen av human melk fra en sekretor, av monoklonale antistoffer spesifikke for sekretor humane blodgruppeantigener (HBGAs), av syntetiske oligosakkaridkonjugater inneholdende sekretorantigener, og ved behandling av vevene med a1,2 fucosidase. NV binder seg også til differensierte CaCo2-celler og differensierte CaCo2-celler uttrykker humane histo-blodgruppeantigener. Transfeksjon av kinesisk hamster-ovarieceller (CHO) med et a1,2-koblet fucosyl-transferase-cDNA tillot binding av NV-viruslignende partikler (VLPs). De bundne rNV-VLP-ene ble internalisert etter inkubering av cellene ved 37oC.

For ytterligere å undersøke sammenhengen mellom sekretorstatus og mottakelighet for Norwalk-virus (NV), samarbeidet vi med Dr. Christine Moe ved Emory University's School of Medicine om en frivillig utfordringsstudie. Denne studien brukte prototypen NV, den første Norovirus-stammen som ble brukt til humane utfordringsstudier. Spyttprøver fra 77 NV-utfordrede frivillige ble testet for sekretorstatus og for NV-binding. Femtifem (71%) av de 77 frivillige var sekretorer. Blant de 55 sekretorene ble 34 (62 %) infisert med NV etter utfordring og spytt fra 41 (75 %) bundne NV-rekombinante VLP-er. Ingen av spyttprøvene fra de 22 ikke-sekretorfrivillige bandt NV-viruslignende partikler (VLP-er), og ingen av dem ble infisert etter NV-utfordring; noe som tyder sterkt på at mottakelighet for NV i det minste delvis bestemmes av vertens evne til å binde norovirusstammen.

Nylig utførte vi en studie for å bestemme om andre stammer av Norovirus har et lignende vertsspesifisitetsmønster og har utvidet bindingsmønstrene til 7 basert på undersøkelse av fjorten Norovirus. De 7 mønstrene er blitt klassifisert i to grupper i henhold til deres interaksjoner med tre hovedepitoper (A/B, H og Lewis) av HBGAs: A/B-bindende gruppe og Lewis-bindende gruppe. Stammer i A/B-bindingsgruppen gjenkjenner A- og/eller B- og H-antigenene, men ikke Lewis-antigenene, mens stammer i den Lewis-bindende gruppen reagerer kun på Lewis- og/eller H-antigenene. Denne klassifiseringen resulterte også i en modell av Norovirus/HBGA-interaksjonen, der maksimalt to bindingsseter innenfor et reseptorbindingsgrensesnitt er involvert i NV/HBGA-interaksjon. A-, B- og H-sidekjedene er ansvarlige for binding av A/B-bindingsstammene mens Lewis-epitopene er ansvarlige for Lewis-bindingsstammene. Fylogenetiske analyser viste at stammer med identiske eller nært beslektede bindingsmønstre hadde en tendens til å bli gruppert, men stammer i begge bindingsgruppene kan finnes i både genogruppe I og II. Resultatene våre antyder at Norovirus har et bredt spekter av vertsområde og humane HBGAer spiller en viktig rolle i Norovirus-evolusjonen.

Siden humane Norovirus ikke kan dyrkes in vitro eller infisere dyr, er det nødvendig å utføre humane frivillige utfordringsstudier for å studere infeksjonens patobiologi. Studien vil fremme konseptet om at Norovirus har et smalt vertsområde som er grunnleggende i patogenesen og immunologien til Norovirus. I tillegg har vi nylig identifisert mer enn et dusin forbindelser som spesifikt blokkerer Norovirus-binding til reseptorene deres. Den menneskelige utfordringsstudien bør også etablere en modell som kan brukes i evalueringen av disse nye forbindelsene med hensyn til deres evne til å blokkere virusreplikasjon (antiviralt medikament). Videre vil vår studie revurdere om ervervet immunitet er en uavhengig faktor i Norovirusinfeksjoner som kan gi ytterligere informasjon om vertsimmunitet som potensielt kan være nyttig i vaksineutvikling. Til slutt vil studien tillate banking av Norovirus-utfordringsstammen ved å samle opp diaré-avføringen som ble sendt av studiepersonene. Banking av ytterligere prøver, som nevnt ovenfor, er avgjørende for fremtidige kliniske studier fordi viruset ikke kan dyrkes in vitro og må isoleres fra mennesker infisert med viruset.

En spesifikk utfordringsstudie vil bare bruke én utfordringsstamme, og enhver utfordringsstamme som brukes i kliniske studier på mennesker vil ha en separat IND- og FDA-godkjenning før administrering til forsøkspersoner.