Susceptibilidad de voluntarios humanos con diferentes histo-sangre con diferentes antígenos de histo-grupos sanguíneos al norovirus

Los norovirus son virus de ARN de sentido positivo de cadena sencilla que causan gastroenteritis aguda en humanos. El prototipo del virus Norwalk (NV) se identificó en un gran brote de gastroenteritis aguda en una escuela primaria en Norwalk, Ohio, en 1968. Desde entonces, muchas cepas han sido descritas y nombradas por la ubicación de su primer aislamiento. Genéticamente, los norovirus pertenecen a uno de los cuatro géneros dentro de Caliciviridae (CV). El análisis filogenético ha demostrado que el género Norovirus se divide en cinco genogrupos y cada genogrupo se puede dividir en grupos genéticos; se han identificado al menos 30 grupos genéticos de norovirus.

Los norovirus han sido reconocidos como la causa más importante de epidemias no bacterianas de gastroenteritis aguda, que afectan a personas de todas las edades, tanto en países en desarrollo como desarrollados. Dichos brotes suelen tener altas tasas de ataque y se han producido en guarderías, escuelas, restaurantes, campamentos de verano, hospitales, residencias de ancianos, barcos (tanto civiles como militares), así como en tropas militares desplegadas. Los virus son altamente contagiosos y pueden sobrevivir en el medio ambiente durante largos períodos de tiempo. Se propagan por contacto con superficies ambientales y transmisión de persona a persona. Los norovirus normalmente causan diarrea de moderada a severa y la enfermedad a menudo es incapacitante y puede ser fatal en jóvenes y ancianos. La preocupación de salud pública más importante es que los norovirus pueden causar grandes brotes transmitidos por el agua y los alimentos, lo que hace que el virus se clasifique como agente de categoría B.

Los norovirus también han estado implicados en varios brotes militares. El "Virus Escudo del Desierto" (DSV) aislado en las tropas estadounidenses en la Guerra del Golfo de 1991 fue posteriormente identificado como un Norovirus. De manera similar, los ataques "misteriosos" recientemente informados de gastroenteritis aguda que afectaron a las tropas británicas en Afganistán también fueron causados ​​por un norovirus. Los grandes brotes de gastroenteritis asociada con el norovirus son comunes en los barcos de la Marina de los EE. UU., similares a los que ocurrieron a bordo de las líneas de cruceros. La vigilancia de la gastroenteritis aguda a bordo de cinco barcos de combate de la Marina de los EE. UU. en 1998-1999 mostró que todos los barcos experimentaron grandes brotes de gastroenteritis aguda por norovirus durante su despliegue en los océanos Pacífico e Índico, luego de visitas a puertos. Debido a la rápida propagación de la enfermedad, muchos departamentos y unidades a bordo de los barcos no pudieron funcionar durante el pico de los brotes.

Los norovirus son difíciles de estudiar porque: 1) son muy diversos desde el punto de vista genético y antigénico y múltiples cepas con distintas identidades genéticas co-circulan en las mismas comunidades, lo que dificulta en extremo el diagnóstico y el control de la enfermedad; y 2) el virus no se puede cultivar en cultivo celular y 3) no existe un modelo animal pequeño para estudiar los norovirus. La clonación molecular del prototipo Norwalk Virus (NV) en 1990 por uno de los co-investigadores de esta aplicación ha permitido un rápido avance en el estudio de los Norovirus y otros géneros; sin embargo, aún se desconocen muchas cuestiones sobre la infección por norovirus, la patogenia, la inmunología y el rango de huéspedes.

El descubrimiento de los receptores de Norovirus brinda nuevas oportunidades para evaluar la patogenia y la epidemiología de los Norovirus. Muchos investigadores sugirieron originalmente un factor genético del huésped relacionado con la infección por norovirus antes de la clonación de norovirus en la década de 1990 porque alrededor del 20-30% de las personas que no tenían anticuerpos contra los norovirus nunca se infectaron después de un desafío con NV, y en brotes, las personas que se mantuvieron saludables se agruparon en familias que tenían la misma exposición a los norovirus que las familias enfermas. Además, los anticuerpos preexistentes contra la NV no protegían contra la infección por NV, mientras que las personas que tenían altos niveles de anticuerpos contra la NV eran más susceptibles a la NV que las personas que no tenían los anticuerpos. Estas observaciones indican que, además de las respuestas inmunitarias, debe haber otro(s) factor(es) que controle(n) la especificidad del huésped de la infección por norovirus.

Recientemente descubrimos que los norovirus reconocen los antígenos del grupo histo-sanguíneo humano como receptores. Usando proteínas recombinantes de la cápside de diferentes Norovirus que representan diferentes grupos genéticos, hemos identificado cuatro patrones de unión de Norovirus a antígenos de grupos sanguíneos humanos, que están definidos por los tipos de sangre Lewis, secretor y ABO del huésped. Este hallazgo proporciona un nuevo enfoque para desarrollar estrategias para controlar la enfermedad. Específicamente, si los norovirus dependen de los antígenos del grupo histo-sanguíneo en las superficies de las células epiteliales intestinales como receptores, se podría desarrollar un compuesto que inhiba la interacción entre el virus y los receptores como un fármaco antiviral para los norovirus. Este hallazgo proporciona la base para este protocolo que busca confirmar la relación entre la susceptibilidad específica de Norovirus y la presencia de antígenos de histogrupos sanguíneos específicos, así como establecer un modelo para evaluar futuras intervenciones (medicamentos y vacunas).

La especificidad de la interacción de NV con los restos de azúcar de los antígenos del grupo histo-sanguíneo se demostró mediante el bloqueo específico de la unión por la leche humana de un secretor, por anticuerpos monoclonales específicos para antígenos secretores del grupo sanguíneo humano (HBGA), por conjugados de oligosacáridos sintéticos. que contienen antígenos secretores, y por tratamiento de los tejidos con a1,2 fucosidasa. NV también se une a las células CaCo2 diferenciadas y las células CaCo2 diferenciadas expresan antígenos del grupo histo-sanguíneo humano. La transfección de células de ovario de hámster chino (CHO) con un ADNc de fucosiltransferasa unido a α1,2 permitió la unión de partículas similares al virus NV (VLP). Las VLP de rNV unidas se internalizaron después de la incubación de las células a 37oC.

Para investigar más a fondo la asociación entre el estado secretor y la susceptibilidad al virus de Norwalk (NV), colaboramos con la Dra. Christine Moe de la Facultad de Medicina de la Universidad de Emory en un estudio de desafío voluntario. Este estudio utilizó el prototipo NV, la primera cepa de norovirus que se utilizó para estudios de desafío en humanos. Se analizó el estado secretor y la unión a NV en muestras de saliva de 77 voluntarios expuestos a NV. Cincuenta y cinco (71%) de los 77 voluntarios eran secretores. Entre los 55 secretores, 34 (62 %) se infectaron con NV después de la exposición y la saliva de 41 (75 %) VLP recombinantes de NV unidas. Ninguna de las muestras de saliva de los 22 voluntarios no secretores se unió a partículas similares al virus NV (VLP) y ninguno de ellos se infectó después del desafío NV; lo que sugiere fuertemente que la susceptibilidad a NV está determinada, al menos en parte, por la capacidad del huésped para unirse a la cepa de norovirus.

Más recientemente, realizamos un estudio para determinar si otras cepas de norovirus tienen un patrón similar de especificidad de huésped y hemos ampliado los patrones de unión a 7 según el examen de catorce norovirus. Los 7 patrones se han clasificado en dos grupos según sus interacciones con tres epítopos principales (A/B, H y Lewis) de HBGA: el grupo de unión A/B y el grupo de unión de Lewis. Las cepas en el grupo de unión A/B reconocen los antígenos A y/o B y H, pero no los antígenos de Lewis, mientras que las cepas en el grupo de unión de Lewis reaccionan solo a los antígenos de Lewis y/o H. Esta clasificación también dio como resultado un modelo de la interacción Norovirus/HBGA, en el que un máximo de dos sitios de unión dentro de una interfaz de unión del receptor están involucrados en la interacción NV/HBGA. Las cadenas laterales A, B y H son responsables de la unión de las cepas de unión A/B, mientras que los epítopos de Lewis son responsables de las cepas de unión de Lewis. Los análisis filogenéticos mostraron que las cepas con patrones de unión idénticos o estrechamente relacionados tendían a agruparse, pero las cepas en ambos grupos de unión se pueden encontrar en los genogrupos I y II. Nuestros resultados sugieren que los norovirus tienen un amplio espectro de huéspedes y que los HBGA humanos juegan un papel importante en la evolución de los norovirus.

Dado que los norovirus humanos no se pueden cultivar in vitro ni infectar a los animales, es necesario realizar estudios de provocación en voluntarios humanos para estudiar la patobiología de la infección. El estudio promoverá el concepto de que los norovirus tienen un rango de huéspedes estrecho, lo cual es fundamental en la patogenia e inmunología de los norovirus. Además, recientemente hemos identificado más de una docena de compuestos que bloquean específicamente la unión de los norovirus a sus receptores. El estudio de provocación en humanos también debería establecer un modelo que pueda utilizarse en la evaluación de estos nuevos compuestos con respecto a su capacidad para bloquear la replicación del virus (fármaco antiviral). Además, nuestro estudio volverá a evaluar si la inmunidad adquirida es un factor independiente en las infecciones por norovirus que puede proporcionar información adicional sobre la inmunidad del huésped potencialmente útil en el desarrollo de vacunas. Finalmente, el estudio permitirá el almacenamiento de la cepa de desafío de Norovirus al recolectar las heces diarreicas de los sujetos del estudio. El almacenamiento de muestras adicionales, como se mencionó anteriormente, es fundamental para futuros ensayos clínicos porque el virus no se puede cultivar in vitro y debe aislarse de humanos infectados con el virus.

Un estudio de desafío específico solo usaría una cepa de desafío y cualquier cepa de desafío utilizada en ensayos clínicos en humanos tendría una aprobación separada de IND y FDA antes de la administración a los sujetos.