Suscettibilità di volontari umani con diverso isto-sangue con diversi antigeni del gruppo isto-sanguigno al Norovirus

I norovirus sono virus a RNA a filamento singolo e senso positivo che causano gastroenterite acuta nell'uomo. Il prototipo del virus Norwalk (NV) è stato identificato in una grande epidemia di gastroenterite acuta in una scuola elementare a Norwalk, Ohio, nel 1968. Da allora, molti ceppi sono stati descritti e nominati in base ai luoghi del loro primo isolamento. Geneticamente, i Norovirus appartengono a uno dei quattro generi all'interno di Caliciviridae (CV). L'analisi filogenetica ha dimostrato che il genere Norovirus è diviso in cinque genogruppi e ciascun genogruppo può essere ulteriormente suddiviso in cluster genetici; sono stati identificati almeno 30 gruppi genetici di Norovirus.

I norovirus sono stati riconosciuti come la causa più importante di epidemie non batteriche di gastroenterite acuta, che colpiscono individui di tutte le età, sia nei paesi in via di sviluppo che in quelli sviluppati. Tali focolai di solito hanno alti tassi di attacco e si sono verificati in asili nido, scuole, ristoranti, campi estivi, ospedali, case di cura, navi (sia civili che militari) nonché truppe militari dispiegate. I virus sono altamente contagiosi e sono in grado di sopravvivere nell'ambiente per lunghi periodi di tempo. Si diffondono per contatto con superfici ambientali e trasmissione da persona a persona. I norovirus normalmente causano diarrea da moderata a grave e la malattia è spesso invalidante e può essere fatale nei giovani e negli anziani. La più importante preoccupazione per la salute pubblica è che i norovirus possono causare grandi epidemie di origine idrica e alimentare, con il risultato che il virus viene classificato come agente di categoria B.

I norovirus sono stati anche implicati in diverse epidemie militari. Il "Desert Shield virus" (DSV) isolato nelle truppe statunitensi durante la Guerra del Golfo del 1991 è stato successivamente identificato come Norovirus. Allo stesso modo, anche i "misteriosi" attacchi di gastroenterite acuta recentemente segnalati che hanno colpito le truppe britanniche in Afghanistan sono stati causati da un Norovirus. Grandi focolai di gastroenterite associata a Norovirus sono comuni sulle navi della Marina degli Stati Uniti, simili a quelli che si sono verificati a bordo delle navi da crociera. La sorveglianza della gastroenterite acuta a bordo di cinque navi da combattimento della Marina degli Stati Uniti nel 1998-1999 ha mostrato che tutte le navi hanno sperimentato grandi focolai di gastroenterite acuta da Norovirus durante il loro dispiegamento nell'Oceano Pacifico e nell'Oceano Indiano, a seguito di visite in porto. A causa della rapida diffusione della malattia, molti reparti e unità a bordo delle navi non sono stati in grado di funzionare durante il picco delle epidemie.

I norovirus sono difficili da studiare perché: 1) sono geneticamente e antigenicamente molto diversi e più ceppi con identità genetiche distinte co-circolano nelle stesse comunità, rendendo estremamente difficile la diagnosi e il controllo della malattia; e 2) il virus non può essere coltivato in coltura cellulare e 3) non esiste un piccolo modello animale per lo studio dei Norovirus. La clonazione molecolare del prototipo Norwalk Virus (NV) nel 1990 da parte di uno dei co-ricercatori di questa applicazione ha consentito rapidi progressi nello studio dei Norovirus e di altri generi; tuttavia, molti problemi sull'infezione da Norovirus, la patogenesi, l'immunologia e la gamma di ospiti rimangono sconosciuti.

La scoperta dei recettori del Norovirus offre nuove opportunità per valutare la patogenesi e l'epidemiologia dei Norovirus. Un fattore genetico dell'ospite che coinvolge l'infezione da Norovirus è stato originariamente suggerito da molti ricercatori prima della clonazione dei Norovirus negli anni '90 perché circa il 20-30% degli individui che non avevano anticorpi contro i Norovirus non sono mai stati infettati a seguito di una sfida con NV, e in epidemie, individui quelli che sono rimasti sani sono stati raggruppati in famiglie che avevano la stessa esposizione ai Norovirus delle famiglie malate. Inoltre, gli anticorpi preesistenti contro la NV non erano protettivi contro l'infezione da NV, mentre gli individui che avevano alti livelli di anticorpi contro la NV erano più suscettibili alla NV rispetto agli individui che non avevano gli anticorpi. Queste osservazioni indicano che, oltre alle risposte immunitarie, devono esserci altri fattori che controllano la specificità dell'ospite dell'infezione da Norovirus.

Recentemente abbiamo scoperto che i Norovirus riconoscono gli antigeni del gruppo istosanguigno umano come recettori. Utilizzando proteine ​​del capside ricombinanti di diversi Norovirus che rappresentano diversi cluster genetici, abbiamo identificato quattro modelli di legame dei Norovirus agli antigeni del gruppo sanguigno umano, che sono definiti dall'ospite Lewis, secretore e gruppi sanguigni ABO. Questa scoperta fornisce un nuovo approccio per sviluppare strategie per controllare la malattia. Nello specifico, se i Norovirus si affidano agli antigeni del gruppo sanguigno sulla superficie delle cellule epiteliali intestinali come recettori, si potrebbe sviluppare un composto che inibisce l'interazione tra il virus e i recettori come farmaco antivirale per i Norovirus. Questa scoperta fornisce la base per questo protocollo che cerca di confermare la relazione tra la suscettibilità specifica del Norovirus e la presenza specifica dell'antigene del gruppo sanguigno, nonché stabilire un modello per valutare gli interventi futuri (farmaci e vaccini).

La specificità dell'interazione NV con le frazioni zuccherine degli antigeni del gruppo sanguigno isto è stata dimostrata dal blocco specifico del legame da parte del latte umano da un secretore, da anticorpi monoclonali specifici per gli antigeni del gruppo sanguigno umano secretore (HBGA), da coniugati oligosaccaridici sintetici contenenti antigeni secretori e mediante trattamento dei tessuti con a1,2 fucosidasi. NV si lega anche alle cellule CaCo2 differenziate e le cellule CaCo2 differenziate esprimono antigeni del gruppo istosanguigno umano. La trasfezione di cellule ovariche di criceto cinese (CHO) con un cDNA di fucosil-transferasi legato a1,2 ha consentito l'adesione di particelle simili a virus NV (VLP). I VLP rNV legati sono stati interiorizzati dopo l'incubazione delle cellule a 37°C.

Per indagare ulteriormente sull'associazione tra stato secretore e suscettibilità al virus Norwalk (NV), abbiamo collaborato con la dott.ssa Christine Moe presso la School of Medicine della Emory University in uno studio di sfida volontario. Questo studio ha utilizzato il prototipo NV, il primo ceppo di Norovirus da utilizzare per studi di provocazione umana. I campioni di saliva di 77 volontari affetti da NV sono stati testati per lo stato dei secretori e per il legame con NV. Cinquantacinque (71%) dei 77 volontari erano secretori. Tra i 55 secretori, 34 (62%) sono stati infettati da NV in seguito a sfida e saliva da 41 (75%) VLP ricombinanti NV legati. Nessuno dei campioni di saliva dei 22 volontari non secretori ha legato particelle simili a virus NV (VLP) e nessuno di loro è stato infettato a seguito della sfida NV; suggerendo fortemente che la suscettibilità alla NV è determinata almeno in parte dalla capacità dell'ospite di legare il ceppo di norovirus.

Più recentemente abbiamo eseguito uno studio per determinare se altri ceppi di Norovirus hanno un modello simile di specificità dell'ospite e abbiamo esteso i modelli di legame a 7 sulla base dell'esame di quattordici Norovirus. I 7 modelli sono stati classificati in due gruppi in base alle loro interazioni con tre principali epitopi (A/B, H e Lewis) degli HBGA: il gruppo di legame A/B e il gruppo di legame di Lewis. I ceppi del gruppo di legame A/B riconoscono gli antigeni A e/o B e H, ma non gli antigeni di Lewis, mentre i ceppi del gruppo di legame Lewis reagiscono solo agli antigeni di Lewis e/o H. Questa classificazione ha portato anche a un modello dell'interazione Norovirus/HBGA, in cui un massimo di due siti di legame all'interno di un'interfaccia di legame del recettore sono coinvolti nell'interazione NV/HBGA. Le catene laterali A, B e H sono responsabili del legame da parte dei ceppi di legame A/B mentre gli epitopi di Lewis sono responsabili dei ceppi di legame di Lewis. Le analisi filogenetiche hanno mostrato che i ceppi con modelli di legame identici o strettamente correlati tendevano a essere raggruppati, ma i ceppi in entrambi i gruppi di legame possono essere trovati in entrambi i genogruppi I e II. I nostri risultati suggeriscono che i Norovirus hanno un ampio spettro di gamma di ospiti e gli HBGA umani svolgono un ruolo importante nell'evoluzione dei Norovirus.

Poiché i Norovirus umani non possono essere coltivati ​​in vitro o infettare gli animali, è necessario eseguire studi di provocazione su volontari umani per studiare la patobiologia dell'infezione. Lo studio approfondirà il concetto che il Norovirus ha una gamma ristretta di ospiti che è fondamentale nella patogenesi e nell'immunologia dei Norovirus. Inoltre, recentemente abbiamo identificato più di una dozzina di composti che bloccano specificamente l'attaccamento del Norovirus ai suoi recettori. Lo studio di provocazione umana dovrebbe anche stabilire un modello che possa essere utilizzato nella valutazione di questi nuovi composti per quanto riguarda la loro capacità di bloccare la replicazione del virus (farmaco antivirale). Inoltre, il nostro studio rivaluterà se l'immunità acquisita è un fattore indipendente nelle infezioni da Norovirus che può fornire ulteriori informazioni sull'immunità dell'ospite potenzialmente utili nello sviluppo del vaccino. Infine, lo studio consentirà il deposito del ceppo di sfida Norovirus raccogliendo le feci diarroiche emesse dai soggetti dello studio. La conservazione di ulteriori campioni, come menzionato sopra, è fondamentale per futuri studi clinici perché il virus non può essere coltivato in vitro e deve essere isolato da esseri umani infettati dal virus.

Uno studio di sfida specifico utilizzerebbe solo un ceppo di sfida e qualsiasi ceppo di sfida utilizzato negli studi clinici sull'uomo avrebbe un'approvazione separata dell'IND e della FDA prima della somministrazione ai soggetti.