Восприимчивость людей-добровольцев с различной гистологической кровью с различными антигенами гистологической группы крови к норовирусу

Норовирусы представляют собой одноцепочечные РНК-вирусы с положительным смыслом, вызывающие острый гастроэнтерит у людей. Прототип вируса Норуолк (НВ) был идентифицирован во время крупной вспышки острого гастроэнтерита в начальной школе в Норуолке, штат Огайо, в 1968 году. С тех пор многие штаммы были описаны и названы по местам их первой изоляции. Генетически норовирусы принадлежат к одному из четырех родов Caliciviridae (CV). Филогенетический анализ показал, что род Norovirus делится на пять геногрупп, и каждая геногруппа может быть дополнительно разделена на генетические кластеры; идентифицировано не менее 30 генетических кластеров норовирусов.

Норовирусы были признаны наиболее важной причиной небактериальных эпидемий острого гастроэнтерита, поражающих людей всех возрастов как в развивающихся, так и в развитых странах. Такие вспышки, как правило, имеют высокий уровень заболеваемости и происходят в детских садах, школах, ресторанах, летних лагерях, больницах, домах престарелых, на кораблях (как гражданских, так и военных), а также в дислоцированных вооруженных силах. Вирусы очень заразны и способны выживать в окружающей среде в течение длительного периода времени. Они распространяются при контакте с поверхностями окружающей среды и при передаче от человека к человеку. Норовирусы обычно вызывают умеренную или тяжелую диарею, заболевание часто приводит к потере трудоспособности и может привести к летальному исходу у молодых и пожилых людей. Наиболее важной проблемой общественного здравоохранения является то, что норовирусы могут вызывать крупные вспышки заболеваний, передающихся через воду и продукты питания, в результате чего вирус классифицируется как возбудитель категории B.

Норовирусы также были причастны к нескольким военным вспышкам. Вирус «Щит пустыни» (DSV), выделенный в войсках США во время войны в Персидском заливе 1991 года, впоследствии был идентифицирован как норовирус. Точно так же недавно сообщенные «таинственные» приступы острого гастроэнтерита, поразившие британские войска в Афганистане, также были вызваны норовирусом. Крупные вспышки гастроэнтерита, связанного с норовирусом, обычны на кораблях ВМС США, подобно тем, которые происходили на борту круизных лайнеров. Наблюдение за острым гастроэнтеритом на борту пяти боевых кораблей ВМС США в 1998-1999 гг. показало, что все корабли испытали крупные вспышки норовирусного острого гастроэнтерита во время их дислокации в Тихом и Индийском океанах после заходов в порты. Из-за быстрого распространения заболевания многие подразделения и подразделения на борту кораблей не могли функционировать в пик вспышек.

Норовирусы трудно изучать, потому что: 1) они генетически и антигенно очень разнообразны, и несколько штаммов с различными генетическими особенностями циркулируют в одних и тех же сообществах, что чрезвычайно затрудняет диагностику и борьбу с болезнями; и 2) вирус нельзя культивировать в клеточной культуре и 3) не существует модели мелких животных для изучения норовирусов. Молекулярное клонирование прототипа Norwalk Virus (NV) в 1990 году одним из соисследователей этого приложения позволило быстро продвинуться в изучении норовирусов и других родов; однако многие вопросы норовирусной инфекции, патогенеза, иммунологии и круга хозяев остаются неизвестными.

Открытие рецепторов норовирусов предоставляет новые возможности для оценки патогенеза и эпидемиологии норовирусов. Генетический фактор хозяина, связанный с норовирусной инфекцией, первоначально предполагался многими исследователями до клонирования норовирусов в 1990-х годах, потому что около 20-30% людей, у которых не было антител против норовирусов, никогда не были инфицированы после заражения НВ, а во время вспышек, люди которые остались здоровыми, были сгруппированы в семьях, которые подверглись такому же воздействию норовирусов, как и больные семьи. Кроме того, ранее существовавшие антитела против NV не защищали от инфекции NV, в то время как люди с высоким уровнем антител против NV были более восприимчивы к NV, чем люди, у которых антител не было. Эти наблюдения показывают, что в дополнение к иммунным ответам должен существовать еще один фактор (факторы), который контролирует специфичность норовирусной инфекции к хозяину.

Недавно мы обнаружили, что норовирусы распознают антигены группы гистокрови человека в качестве рецепторов. Используя рекомбинантные капсидные белки из разных норовирусов, представляющих разные генетические кластеры, мы определили четыре модели связывания норовирусов с антигенами групп гистокрови человека, которые определяются группами крови хозяина по Льюису, секреторной и АВО. Это открытие обеспечивает новый подход к разработке стратегий борьбы с болезнью. В частности, если норовирусы полагаются на антигены группы гистокрови на поверхности эпителиальных клеток кишечника в качестве рецепторов, соединение, которое ингибирует взаимодействие между вирусом и рецепторами, может быть разработано в качестве противовирусного препарата для норовирусов. Этот вывод обеспечивает основу для этого протокола, который направлен на подтверждение взаимосвязи между конкретной восприимчивостью к норовирусу и присутствием специфического антигена группы гисто-крови, а также на создание модели для оценки будущих вмешательств (лекарств и вакцин).

Специфичность взаимодействия НВ с сахарными фрагментами антигенов гистогрупп крови показана специфическим блокированием связывания человеческим молоком из секретора, моноклональными антителами, специфичными к секреторным антигенам групп крови человека (HBGAs), синтетическими олигосахаридными конъюгатами. содержащие секреторные антигены, и обработкой тканей а1,2 фукозидазой. NV также связывается с дифференцированными клетками CaCo2, а дифференцированные клетки CaCo2 экспрессируют антигены группы гистокрови человека. Трансфекция клеток яичника китайского хомячка (CHO) кДНК α1,2-связанной фукозилтрансферазы позволила прикрепить вирусоподобные частицы NV (VLP). Связанные VLP rNV интернализовали после инкубации клеток при 37oC.

Для дальнейшего изучения связи между секреторным статусом и восприимчивостью к вирусу Норуолк (NV) мы сотрудничали с доктором Кристин Мо из Медицинской школы Университета Эмори в исследовании с участием добровольцев. В этом исследовании использовался прототип NV, первый штамм норовируса, который будет использоваться для исследований заражения человека. Образцы слюны 77 добровольцев, зараженных NV, были протестированы на секреторный статус и связывание NV. Пятьдесят пять (71%) из 77 добровольцев были секреторами. Среди 55 секреторов 34 (62%) были инфицированы NV после заражения и слюны от 41 (75%) связанных рекомбинантных VLP NV. Ни один из образцов слюны от 22 несекретирующих добровольцев не связал вирусоподобные частицы (VLP) NV, и ни один из них не заразился после заражения NV; убедительно свидетельствует о том, что восприимчивость к NV определяется, по крайней мере частично, способностью хозяина связывать штамм норовируса.

Совсем недавно мы провели исследование, чтобы определить, имеют ли другие штаммы норовирусов аналогичный паттерн специфичности к хозяину, и расширили паттерны связывания до 7 на основе изучения четырнадцати норовирусов. Семь паттернов были разделены на две группы в соответствии с их взаимодействием с тремя основными эпитопами (А/В, Н и Льюис) HBGA: группа связывания А/В и группа связывания Льюиса. Штаммы в группе связывания А/В распознают антигены А и/или В и Н, но не антигены Льюиса, в то время как штаммы в группе связывания Льюиса реагируют только на антигены Льюиса и/или Н. Эта классификация также привела к созданию модели взаимодействия норовирус/HBGA, в которой максимум два сайта связывания в пределах интерфейса связывания рецептора участвуют во взаимодействии NV/HBGA. Боковые цепи А, В и Н отвечают за связывание штаммов, связывающих А/В, в то время как эпитопы Льюиса отвечают за связывание штаммов Льюиса. Филогенетический анализ показал, что штаммы с идентичными или близкородственными паттернами связывания имеют тенденцию к группированию, но штаммы в обеих группах связывания могут быть обнаружены как в геногруппах I, так и в геногруппах II. Наши результаты показывают, что норовирусы имеют широкий спектр хозяев, и человеческие HBGA играют важную роль в эволюции норовирусов.

Поскольку норовирусы человека нельзя культивировать in vitro или заражать животных, необходимо провести исследования на людях-добровольцах для изучения патобиологии инфекции. Исследование будет способствовать развитию концепции о том, что норовирус имеет узкий круг хозяев, что имеет основополагающее значение для патогенеза и иммунологии норовирусов. Кроме того, недавно мы идентифицировали более дюжины соединений, которые специфически блокируют прикрепление норовирусов к их рецепторам. Исследование заражения человека должно также создать модель, которую можно использовать для оценки этих новых соединений в отношении их способности блокировать репликацию вируса (противовирусный препарат). Кроме того, в нашем исследовании будет проведена повторная оценка того, является ли приобретенный иммунитет независимым фактором норовирусных инфекций, что может предоставить дополнительную информацию об иммунитете хозяина, потенциально полезную при разработке вакцины. Наконец, исследование позволит создать банк контрольного штамма норовируса путем сбора диарейного стула, выделяемого субъектами исследования. Хранение дополнительных образцов, как упоминалось выше, имеет решающее значение для будущих клинических испытаний, поскольку вирус нельзя культивировать in vitro и его необходимо выделять от людей, инфицированных вирусом.

В конкретном контрольном исследовании будет использоваться только один контрольный штамм, и любой контрольный штамм, используемый в клинических испытаниях на людях, будет иметь отдельное одобрение IND и FDA перед введением субъектам.