Modtagelighed af menneskelige frivillige med forskelligt histo-blod med forskellige histo-blodgruppeantigener for Norovirus

Norovira er enkeltstrengede RNA-vira med positiv sans, der forårsager akut gastroenteritis hos mennesker. Prototypen Norwalk-virus (NV) blev identificeret i et stort udbrud af akut gastroenteritis i en folkeskole i Norwalk, Ohio, i 1968. Siden da er mange stammer blevet beskrevet og navngivet efter placeringen af ​​deres første isolation. Genetisk hører Norovirus til en af ​​fire slægter inden for Caliciviridae (CV). Fylogenetisk analyse har vist, at Norovirus-slægten er opdelt i fem genogrupper, og hver genogruppe kan yderligere opdeles i genetiske klynger; mindst 30 genetiske klynger af Norovirus er blevet identificeret.

Norovira er blevet anerkendt som den vigtigste årsag til ikke-bakterielle epidemier af akut gastroenteritis, der påvirker individer i alle aldre, i både udviklingslande og udviklede lande. Sådanne udbrud har normalt høje angrebsrater og er forekommet i børnepasningscentre, skoler, restauranter, sommerlejre, hospitaler, plejehjem, skibe (både civile og militære) samt udsendte militærtropper. Vira er meget smitsom og er i stand til at overleve i miljøet i længere perioder. De spredes ved kontakt med overflader i omgivelserne og smitte fra person til person. Norovira forårsager normalt moderat til svær diarré, og sygdommen er ofte invaliderende og kan være dødelig hos unge og ældre. Den vigtigste bekymring for folkesundheden er, at Norovirus kan forårsage store vand- og fødevarebårne udbrud, hvilket resulterer i, at virussen klassificeres som et kategori B-agens.

Norovirus har også været impliceret i adskillige militære udbrud. "Desert Shield virus" (DSV), der blev isoleret i amerikanske tropper i Golfkrigen i 1991, blev efterfølgende identificeret som en Norovirus. Tilsvarende blev de nyligt rapporterede "mystiske" angreb af akut gastroenteritis, der påvirker de britiske tropper i Afghanistan, også forårsaget af en Norovirus. Store udbrud af Norovirus-associeret gastroenteritis er almindelige på US Navy-skibe, svarende til dem, der opstod om bord på krydstogtskibslinjer. Overvågning af akut gastroenteritis om bord på fem amerikanske flådes kampskibe i 1998-1999 viste, at alle skibene oplevede store udbrud af Norovirus akut gastroenteritis under deres udsendelse i Stillehavet og Det Indiske Ocean efter havnebesøg. På grund af den hurtige spredning af sygdommen var mange afdelinger og enheder om bord på skibene ude af stand til at fungere under toppen af ​​udbruddene.

Norovira er vanskelige at studere, fordi: 1) de er genetisk og antigenisk meget forskellige og multiple stammer med forskellige genetiske identiteter co-cirkulerer i de samme samfund, hvilket gør diagnose og sygdomsbekæmpelse ekstremt vanskelig; og 2) virussen kan ikke dyrkes i cellekultur og 3) der eksisterer ingen lille dyremodel til at studere norovira. Den molekylære kloning af prototypen Norwalk Virus (NV) i 1990 af en af ​​medforskerne i denne ansøgning har muliggjort hurtige fremskridt i undersøgelsen af ​​Norovira og andre slægter; dog forbliver mange problemer vedrørende Norovirus-infektion, patogenese, immunologi og værtsområde ukendte.

Opdagelsen af ​​Norovirus-receptorer giver nye muligheder for at evaluere patogenesen og epidemiologien af ​​Norovirus. En genetisk værtsfaktor, der involverer Norovirus-infektion, blev oprindeligt foreslået af mange forskere før kloningen af ​​Norovirus i 1990'erne, fordi omkring 20-30 % af individer, der ikke havde antistoffer mod Norovirus, aldrig blev inficeret efter en udfordring med NV, og i udbrud, individer som forblev raske blev grupperet i familier, der havde samme eksponering for Norovirus som de syge familier. Ydermere var præ-eksisterende antistoffer mod NV ikke beskyttende mod NV-infektion, mens individer, der havde høje niveauer af antistoffer mod NV, var mere modtagelige for NV end individer, der ikke havde antistofferne. Disse observationer indikerer, at der ud over immunresponser skal være en eller flere andre faktorer, der styrer værtsspecificiteten af ​​Norovirusinfektion.

Vi har for nylig opdaget, at Norovirus genkender humane histo-blodgruppeantigener som receptorer. Ved at bruge rekombinante capsidproteiner fra forskellige norovira, der repræsenterer forskellige genetiske klynger, har vi identificeret fire bindingsmønstre af norovira til humane histo-blodgruppeantigener, som er defineret af værten Lewis, sekretor og ABO-blodtyper. Dette fund giver en ny tilgang til at udvikle strategier til at kontrollere sygdommen. Specifikt, hvis Norovira er afhængige af histo-blodgruppeantigener på overfladerne af tarmepitelcellerne som receptorer, kan en forbindelse, der hæmmer interaktionen mellem virus og receptorer, udvikles som et antiviralt lægemiddel til Norovira. Dette fund udgør grundlaget for denne protokol, som søger at bekræfte forholdet mellem specifik Norovirus-modtagelighed og specifik histo-blodgruppeantigen-tilstedeværelse samt etablere en model til at evaluere fremtidige interventioner (lægemidler og vacciner).

Specificiteten af ​​NV-interaktionen med sukkerdelene af histo-blodgruppeantigener blev vist ved specifik blokering af bindingen af ​​human mælk fra en sekretor, af monoklonale antistoffer, der er specifikke for sekretor humane blodgruppeantigener (HBGA'er), af syntetiske oligosaccharidkonjugater indeholdende sekretorantigener og ved behandling af vævene med a1,2-fucosidase. NV binder også til differentierede CaCo2-celler, og differentierede CaCo2-celler udtrykker humane histo-blodgruppeantigener. Transfektion af kinesisk hamster-ovarieceller (CHO) med et a1,2-bundet fucosyl-transferase-cDNA tillod binding af NV-viruslignende partikler (VLP'er). De bundne rNV VLP'er blev internaliseret efter inkubation af cellerne ved 37oC.

For yderligere at undersøge sammenhængen mellem sekretorstatus og modtagelighed for Norwalk-virus (NV) samarbejdede vi med Dr. Christine Moe ved Emory University's School of Medicine om en frivillig udfordringsundersøgelse. Denne undersøgelse brugte prototypen NV, den første Norovirus-stamme, der blev brugt til humane udfordringsundersøgelser. Spytprøver fra 77 NV-udfordrede frivillige blev testet for sekretorstatus og for NV-binding. Femoghalvtreds (71%) af de 77 frivillige var sekretorer. Blandt de 55 sekretorer var 34 (62%) inficeret med NV efter belastning og spyt fra 41 (75%) bundne NV-rekombinante VLP'er. Ingen af ​​spytprøverne fra de 22 ikke-sekretoriske frivillige bandt NV-viruslignende partikler (VLP'er), og ingen af ​​dem blev inficeret efter NV-påvirkning; hvilket kraftigt antyder, at modtageligheden for NV i det mindste delvist bestemmes af værtens evne til at binde norovirus-stammen.

For nylig udførte vi en undersøgelse for at bestemme, om andre stammer af norovira har et lignende mønster af værtsspecificitet og har udvidet bindingsmønstrene til 7 baseret på undersøgelse af fjorten norovira. De 7 mønstre er blevet klassificeret i to grupper i henhold til deres interaktioner med tre hovedepitoper (A/B, H og Lewis) af HBGA'er: A/B-bindingsgruppen og Lewis-bindende gruppe. Stammer i A/B-bindingsgruppen genkender A- og/eller B- og H-antigenerne, men ikke Lewis-antigenerne, mens stammer i den Lewis-bindende gruppe kun reagerer på Lewis- og/eller H-antigenerne. Denne klassificering resulterede også i en model af Norovirus/HBGA-interaktionen, hvor maksimalt to bindingssteder inden for en receptorbindingsgrænseflade er involveret i NV/HBGA-interaktion. A-, B- og H-sidekæderne er ansvarlige for binding af A/B-bindingsstammerne, mens Lewis-epitoperne er ansvarlige for Lewis-bindingsstammerne. Fylogenetiske analyser viste, at stammer med identiske eller nært beslægtede bindingsmønstre havde tendens til at være klyngede, men stammer i begge bindingsgrupper kan findes i både genogruppe I og II. Vores resultater tyder på, at Norovirus har et bredt spektrum af værtsområde, og humane HBGA'er spiller en vigtig rolle i Norovirus-evolution.

Da humane Norovirus ikke kan dyrkes in vitro eller inficere dyr, er det nødvendigt at udføre humane frivillige udfordringsundersøgelser for at studere infektionens patobiologi. Undersøgelsen vil fremme konceptet om, at Norovirus har et snævert værtsområde, som er fundamentalt i patogenesen og immunologien af ​​Norovirus. Derudover har vi for nylig identificeret mere end et dusin forbindelser, der specifikt blokerer Norovirus-binding til deres receptorer. Den humane udfordringsundersøgelse bør også etablere en model, der kan bruges i evalueringen af ​​disse nye forbindelser med hensyn til deres evne til at blokere virusreplikation (anti-viralt lægemiddel). Desuden vil vores undersøgelse revurdere, om erhvervet immunitet er en uafhængig faktor i Norovirus-infektioner, som kan give yderligere information om værtsimmunitet, der potentielt er nyttig i vaccineudvikling. Endelig vil undersøgelsen give mulighed for banking af Norovirus-udfordringsstammen ved at indsamle diarréafføringen, som forsøgspersonerne passerer. Banking af yderligere prøver, som nævnt ovenfor, er afgørende for fremtidige kliniske forsøg, fordi virussen ikke kan dyrkes in vitro og skal isoleres fra mennesker inficeret med virussen.

Et specifikt udfordringsstudie ville kun bruge én udfordringsstamme, og enhver udfordringsstamme, der anvendes i humane kliniske forsøg, ville have en separat IND- og FDA-godkendelse før administration til forsøgspersoner.