KIDSTAGE- Stadieindelning av njurcancer med Dual Time PET/CT och andra biomarkörer

Bakgrund Njurcellscancer (RCC) representerar 2-3% av alla maligniteter, och den europeiska prevalensen är cirka 84 400 fall per år [1]. I Danmark diagnostiseras 950 nya fall av njurcancer (KC) per år, och incidensen ökar årligen. KC är vanligare hos män än hos kvinnor och cancern debuterar oftast i åldern 60-70 år [2]. Tidiga stadier av KC är ofta asymtomatiska och sjukdomen är därför ofta i framskridet stadium eller till och med metastaserande när den upptäcks. Metastaser inklusive lymfkörtelmetastaser är en prediktor för dålig prognos. Kirurgiskt avlägsnande av cancerlymfkörtlar har visat sig förbättra responsen på systemisk behandling och förlänga överlevnaden [3], men de nuvarande metoderna för detektion av framför allt lymfkörtelmetastaser är otillräckliga. Förbättrade metoder för att upptäcka metastaserande lesioner vid diagnostillfället skulle vara till stor hjälp för de läkare som måste välja den optimala behandlingsstrategin för patienterna. Kirurgi är den enda botande behandlingen och även det dominerande valet av behandling när det är möjligt. Systemisk behandling används endast vid metastaserande sjukdom. Metastatisk KC svarar i allmänhet inte på kemoterapeutika och strålbehandling [2], men en rad andra systemiska behandlingsalternativ har utvecklats under det senaste decenniet. Detta innebär att det är av allt större vikt att följa upp hur patienterna svarar på den valda behandlingen och byta till en annan produkt om tumören inte svarar. Antalet patienter med KC som identifierats av en slump har ökat tillsammans med en ökande användning av rutinundersökning för ett antal andra sjukdomar [4]. Det är fortfarande troligt att nya och förbättrade metoder för tidig upptäckt av cancer skulle förbättra överlevnaden hos KC-patienter.

PET/CT:

Positron Emission Tomography (PET) i kombination med datortomografi (CT) är en väletablerad metod för att diagnostisera och iscensätta flera typer av cancer. 2-deoxi-2-[18F]fluoro-D-glukos (FDG) är det vanligaste PET-spårämnet som används i onkologiska studier. PET/CT är inte en standardmodalitet vid diagnos och stadieindelning av RCC [5]. Känsligheten för detektion av primärtumören hämmas av den fysiologiska utsöndringen av FDG i urinen. Vidare kan histologiska egenskaper hos tumören såsom grad och uttryck av glukostransportörer påverka FDG-upptaget negativt [6]. Men PET/CT fungerar bra vid upptäckt av extrarenala metastaser [7, 8] och visade sig vara av prognostiskt värde vid återkommande RCC [9].

FDG ackumuleras i celler med ökad glykolys, i synnerhet cancerceller. FDG-ackumulering är inte specifik för tumörer och ses även vid benigna processer som inflammation och infektion. Detta gör det svårt att skilja maligna neoplastiska lesioner från de godartade [10]. Under de senaste åren har konceptet med dual-time point (DTP) avbildning utvecklats. Ökningen av FDG-upptag verkar fortsätta i timmar efter injektion i malign vävnad medan FDG-upptag i normal eller inflammerad vävnad når maximalt upptag tidigare och avtar därefter. Således tros sen avbildning resultera i ökat FDG-upptag, minskad blod- och urinaktivitet och därmed ett bättre mål-till-bakgrundsförhållande och därför en högre känslighet [11]. Flera studier med DTP PET/CT har utförts på tumörer i bröst, lever, lunga och prostata. Resultaten indikerar att mönstret och hastigheten för FDG-upptag över tiden varierar avsevärt mellan maligna och godartade processer och att DTP PET/CT möjliggör åtskillnad mellan dem [12,13]. Hittills har användningen av DTP-avbildning i RCC rapporterats knappt. En färsk artikel övervägde värdet av DTP-avbildning av den primära njurtumören men inte av metastaserna [14].

Cirkulerande tumör-DNA Det finns ett allmänt och ökande intresse för cirkulerande cancerbiomarkörer eftersom de kan utgöra representativa avläsningar av både primärtumör och metastaserande avlagringar. Dessutom kan cirkulerande markörer utgöra ett verktyg för att övervaka svar på systematiska adjuvanta terapier även efter att den primära tumören har avlägsnats. Lovande resultat har erhållits för blodfödda cellfria DNA (cfDNA) som kan isoleras från ett enkelt blodprov, ofta kallad flytande biopsi. I motsats till vävnadsbiopsier är detektion av cfDNA från perifert blod ett minimalt invasivt sätt att övervaka sjukdomen under behandling och uppföljning.

cfDNA antas frigöras från de flesta eller alla celler i kroppen och finns i såväl friska som sjuka individer. Flera studier rapporterar att specifika förändringar från tumörvävnad speglas i cfDNA och att det därmed är möjligt att skilja cirkulerande tumör-DNA (ctDNA) från normalt cfDNA. Studier som tillämpar sekvensering av somatiska mutationer i välkända cancergener som TP53, PIK3CA och KRAS har rapporterats och lovande resultat har erhållits för att använda dessa markörer för tidig upptäckt av återfall i kolorektal cancer [15] bröstcancer [16] och lungcancer [17]. En nackdel med detta tillvägagångssätt är att en betydande del av solida tumörer inte innehåller mutationer i dessa kandidatgener. Denna utmaning kan mötas genom att använda nästa generations sekvensering av tumörvävnad för att identifiera tumörspecifika förändringar som sedan kan övervakas i plasma. Två nyare studier tillämpade lågtäckande helgenomsekvensering av tumörvävnad för att detektera tumörspecifik brytpunkt och använde därefter PCR-baserade analyser riktade mot dessa brytpunkter för att upptäcka och övervaka ctDNA-bördan hos patienter med kolorektal cancer [18] och bröstcancer [19]. Metoden visade sig vara mycket känslig och specifik i diskrimineringen mellan patienter med och utan recidiv, och de kunde upptäcka metastaserande recidiv med en ledtid på 10 respektive 11 månader jämfört med konventionella metoder. Dessutom visade Reinert och medarbetare [18] också att nivån av ctDNA varierade med administrering av terapi och att ctDNA kan användas som ett verktyg för att övervaka behandlingssvar. Ett av de mest betydande och tidiga kännetecknen för tumörer är genomisk instabilitet som representerar en drivkraft bakom utvecklingen av terapiresistens och metastasering. Genomisk instabilitet är en av de stora utmaningarna i den systemiska behandlingen av cancer eftersom den resulterande tumörheterogeniteten inte bara är svår att avslöja, utan också dynamisk och därmed utmanande att övervaka i tid. Genetiska profiler för tumörer erhålls vanligtvis från vävnadsbiopsier, men dessa kanske inte avslöjar relevant tumörheterogenitet och invasiviteten av proceduren gör dem olämpliga för sekventiell övervakning under sjukdomsprogression. ctDNA kan representera ett minimalt invasivt sätt att övervaka inte bara tumörbelastning utan också tumörheterogenitet och utveckling mot metastaser.

Hypoteser

1. Ökningen av FDG-upptaget fortsätter i timmar efter injektionen. Sen avbildning (DTP FDG PET/CT) bör resultera i ökat FDG-upptag, minskad blod- och urinaktivitet och därmed ett bättre förhållande mellan skada och bakgrund. Genom att kombinera detta med den patologiska rapporten kanske det går att få en bättre stadieindelning av njurcancerpatienterna.
2. Tumörbelastning, heterogenitet och spridning återspeglas i cirkulerande tumör-DNA (ctDNA), som kan mätas i ett enkelt blodprov. Analys av ctDNA kan förväntas ge information om förändringar i tumörbelastningen före - och under behandlingen, och hos patienter med metastaserad sjukdom och under deras behandling.

Syfte Det primära syftet med dessa prospektiva prövningar är att undersöka användningen av DTP FDG PET/CT vid stadieindelning av lung-, ben- och lymfkörtelmetastaser hos patienter med KC och att undersöka om ctDNA kan användas som ett verktyg för bedömning av tumörbelastning tumörheterogenitet, spridning, för övervakning under behandling och sjukdomsprogression hos KC-patienter.

KIDSTAGE I: DTP FDG PET/CT för detektion av lung-, ben- och lymfkörtelmetastaser hos patienter med KC Population Alla patienter som diagnostiserats med KC på Urologiska avdelningen och Onkologiska avdelningen på OUH är berättigade att delta i studien.

Inklusionskriterier:

• KC-patienter vid Urologisk- och Onkologiska avdelningar på OUH
• Skriftligt medgivande
• Kunna tala och förstå danska

Exklusions kriterier:

• Patienter under 18 år
• Patienter med psykisk funktionsnedsättning
• Återkallande av samtycke
• Andra malignitetsmetoder Patienter som ingår i studien kommer att genomgå en DTP FDG-PET/CT-skanning. Skanningarna kommer att utföras före nefrektomi/administration av onkologisk behandling. Nuklearmedicinska institutionen utför skanningarna med förvärv 1 och 3 timmar efter administrering av FDG-spårämnet. Bilder tolkas av en specialist i nuklearmedicin. Bilder tolkas utifrån visuell utvärdering med kompletterande mätningar av standardiserade upptagsvärden (SUV). SUVmax kommer att fastställas för både det tidiga och sena förvärvet (SUVearly och SUVlate). Ett retentionsindex (RI) kommer att beräknas som (SUVlate - SUVearly)/SUVearly.

Primära målavbildningsvariabler kommer att vara "metastaser till lungorna" (ja/nej), "metastaser till lymfkörtlar" (ja/nej) och "metastaser till ben" (ja/nej). Sekundära analyser kommer att vara lesionsbaserade. I enlighet med lymfkörteldetektering, lesionsbaserad beskriva varje lymfkörtelgrupp. Aktivitet i regionala lymfkörtlar kommer att registreras enligt deras plats; "renal hilus (dx/sin)", "retroperitoneal para aorta" och "para cavale"[2]. Under nefrektomi kommer lymfkörtlarna från de ovan nämnda stationerna att tas bort och placeras i separata behållare märkta som: "renal hilus dx.", "renal hilus sin.", "para aorta" och "para cavale". Patologer kommer att undersöka vävnadsproverna. Resultaten av PET/CT kommer inte att vara tillgängliga för patologen. Resultaten av PET/CT kommer att jämföras med resultat från histologisk undersökning (Gold Standard) och sensitivitet, specificitet, positivt och negativt prediktivt värde kommer att beräknas.

Resultat avseende lung- och skelettmetastaser kommer att jämföras med resultaten av den diagnostiska CT-skanning av bröstkorg/buk som redan är gjord för varje patient som en del av standardundersökningsprogrammet. Vid överenskommelse mellan skanningarna kommer patienten att gå vidare till klinisk behandling som vanligt. I händelse av oenighet mellan modaliteterna angående ben, kommer en magnetisk resonanstomografi (MRT) att utföras av skadan av intresse. Om resultaten efter MRT fortfarande är osäkra kommer en benbiopsi med tonvikt på att få såväl märgvävnad som benmatris att utföras. Detta kommer i många fall inte att vara möjligt på grund av skadans storlek och i dessa fall kommer MRT att fungera som referensstandard.

Alla resultat kommer att kodas och ges ett ID enligt patientens CPR-nummer med hjälp av RedCap informatiska kodsystem.

KIDSTAGE II: Cirkulerande biomarkörer i KC och tumörheterogenitet Population Alla patienter med KC vid Urologiska avdelningen på OUH som opereras och alla patienter inlagda på avdelningarna på OUH som genomgår njurbiopsi för misstänkt njurtumör kommer att anses vara potentiellt lämpliga för inskrivningen.

Inklusionskriterier:

• Patienter med KC utan metastaser behandlade på Urologisk avdelning vid OUH
• Skriftligt medgivande
• Kunna tala och förstå danska uteslutningskriterier
• Som i KIDSTAGE I Metoder Provtagning Ett blodprov (20 ml) kommer att tas preoperativt från varje patient som deltar i studien. Provtagningen kommer att upprepas den första postoperativa dagen medan patienten fortfarande är inlagd på sjukhus och efter 2 veckor, 3, 6 och 12 månader. Alla prover kommer att kodas och ges ett ID enligt patientens CPR-nummer med hjälp av RedCap informatiska kodsystem. Vidare kommer en biopsi av tumören på den kirurgiskt avlägsnade njuren att skickas till patologiska institutionen. Tumörprovet kommer också att kodas enligt RedCap. Storleken på det histologiska provet som porterats för studien kommer att vara 5 mm x 5 mm x 5 mm.

Provanalys Blodproverna kommer att levereras till Institutionen för klinisk genetik vid OUH och kommer att centrifugeras för att separera plasma från blodkroppar och båda fraktionerna kommer att förvaras vid -80C. Isolering av DNA från tumörvävnad, lymfocyter och plasma (cfDNA) kommer att utföras med kommersiella kit.

KIDSTAGE IIa: DNA isolerat från tumörvävnad kommer att utsättas för låg täckning (ungefär 1-3 X) helgenomsekvensering med 2 X 100 parade ändläsningar och långa insättningar. Sekvensering kommer att utföras med hjälp av en Illumina HiSeq1500 belägen vid Institutionen för klinisk genetik i Odense. De stora somatiska mutationerna kommer att filtreras för att undvika kända variationer i antal kopior i könslinjen och kommer slutligen att valideras som somatiska mutationer genom personlig analys av DNA från lymfocyter. Ett stort antal stora somatiska mutationer förväntas identifieras i alla tumörer som använder denna pipeline. Ett mindre antal av 2-3 mutationer från varje tumör kommer att implementeras i en personlig PCR-uppsättning som täcker brytpunkterna för identifierade somatiska mutationer. Kvantifiering kommer att utföras med digital PCR och ett antal hushållningsgener kommer att användas för normalisering. Analyserna kommer att tillämpas på 1) plasmaprover för att detektera och kvantifiera ctDNA och 2) DNA isolerat från cellfraktionen av blodprovet för att validera att mutationerna är somatiska.

KIDSTAGE IIb: För 20 patienter kommer tumörheterogenitet att studeras genom att isolera DNA från 4 oberoende biopsier från den resekerade primärtumören och från normal vävnad (normala blodkroppar). Hel exomsekvensering utförs vid 100X täckning, misstänkta somatiska punktmutationer kallas genom att jämföra sekvenser från tumör och normal vävnad [20] validering och exakta uppskattningar av allelfrekvenser erhålls genom ultradjup (>1000X) riktad sekvensering av misstänkta mutationer. Den subklonala strukturen dechiffreras genom bioinformatisk analys. Denna procedur tillämpades framgångsrikt i en av våra tidigare studier [21]. För att avgöra i vilken utsträckning heterogeniteten återspeglas i ctDNA kommer den ultradjupa sekvenseringen också att utföras på ctDNA från samma patient.

Utsläpp av provförvaring Renade prover kommer att förvaras anonymt i en forskningsbiobank i högst 10 år från insamling. Efter den tiden kommer alla prover att förstöras. Om ytterligare analyser utförs på proverna än de som illustreras i detta protokoll, både för syftet med den här studien eller för nya studier, kommer uttrycklig ersättning att begäras i förväg till den etiska kommittén och till respektive ansvariga organ för dessa ändamål

KIDSTAGE III: Cirkulerande biomarkörer i metastaserande KC och tumörevolution Population Alla patienter med metastaserande KC som behandlas på Onkologiska avdelningen vid OUH kommer att anses vara potentiellt lämpliga för inskrivningen.

Inklusionskriterier:

• Patienter med histologiskt verifierade och metastaserande KC behandlade på onkologisk avdelning vid OUH
• Skriftligt medgivande
• Kunna tala och förstå danska uteslutningskriterier
• Som i KIDSTAGE I Metoder Provtagning För patienter med metastaserande KC i prognosgrupperna "bra" och "mellanliggande" är förstahandsbehandlingen Pazopanib 800 mg dagligen. Detta ges kontinuerligt fram till progression. Utvärdering av behandlingssvar görs av en klinisk kontroll vid Onkologiska avdelningen var 4:e vecka och med en CT-skanning var 3:e månad. För patienter i gruppen med dålig prognos och för patienter med icke-klarcellstyp är förstahandsbehandlingen Sunitinib 50 mg. Detta ges dagligen i 4 veckor och sedan ett uppehåll i 2 veckor. Utvärdering av behandlingssvar görs av en klinisk kontroll vid Onkologiska avdelningen var 6:e ​​vecka och med en CT-skanning var 3:e månad.

Ett blodprov (20 ml) kommer att tas från varje patient innan den onkologiska behandlingen påbörjas. Provtagningen kommer att upprepas efter 2 veckor, 3, 6 och 12 månader. Alla prover kommer att kodas och ges ett ID enligt patientens CPR-nummer med hjälp av RedCap informatiska kodsystem. En ultraljudsvägledd biopsi av primärtumören och metastaserna kommer att tas och skickas till patologiska institutionen, OUH. Detta är en standardprocedur för patienter med metastaserande sjukdom, som är planerade för onkologisk behandling. Tumörprovet kommer också att kodas enligt RedCap.

Provanalys KIDSTAGE IIIa: Som i KIDSTAGE IIa KIDSTAGE IIIb: För 20 patienter studeras tumörutveckling genom att isolera DNA från biopsier från primärtumör, metastaser och normala celler. Liksom i IIb hel exome-sekvensering utförs variantanrop och ultradjup sekvensering. Den genomiska utvecklingen från primär tumör-tp-metastas dechiffreras genom bioinformatikanalys, som vi rapporterat tidigare [22], [23]. För att avgöra i vilken utsträckning denna utveckling återspeglas i ctDNA, kommer ultradjup sekvensering att utföras på ctDNA också.

Förvaring av prov Som i KIDSTAGE II Provstorlek Årligen opereras 100-120 patienter med diagnosen KC på Urologiska avdelningen på OUH och 70-80 patienter med metastaserande KC behandlas på Onkologiska avdelningen på OUH. Cirka 75 patienter kommer att vara ett realistiskt antal patienter att registrera sig i den övergripande studien. Eftersom detta är en explorativ studie och inga andra större studier har undersökt detta har det inte varit möjligt att göra effektberäkningar för urvalsstorleken.

Genomförbarhet Patienterna kommer att inkluderas i studien när diagnosen KC har ställts på Urologiska avdelningen eller på Onkologiska avdelningen på OUH. Kontakten till patienterna kommer att underlättas av Louise Geertsen. Insamling av blodprover kommer att utföras av tekniker eller av Louise Geertsen.

Sekvensering, dataanalys och ddPCR kommer att utföras vid Institutionen för klinisk genetik vid OUH. Avdelningen har Illumina HiSeq-teknologin och datorkraft för Next Generation Sequencing (NGS) och har implementerat NIPT som en klinisk analys. Prof. Torben A. Kruse och hans team har mångårig erfarenhet av NGS och cancerforskning, och omfattande teknisk och bioinformatisk kunskap inklusive detektion av brytpunkter och kopienummervariationer från NGS har erhållits[20,21,22,23]. DTP PET/CT-skanningarna kommer att utföras på Nuklearmedicinska institutionen, OUH. Avdelningen har mångårig erfarenhet av att utföra och tolka FDG PET/CT och DTP FDG PET/CT [24,25,26]. Bilderna kommer att tolkas av Jane Simonsen, doktor och konsult vid Nuklearmedicinska institutionen eller en ersättare för henne. Histologisk undersökning av tumörbiopsier kommer att underlättas av vår samarbetspartner Niels Marcussen, professor och konsult vid Institutionen för patologi.

Etik

Etiska aspekter som ska beaktas i KIDSTAGE I:

De flesta patienter kommer att vara 60 år eller äldre vid tidpunkten för diagnosen, och få om några kommer att vara yngre än 50 år. I Danmark är den teoretiska livstidsrisken att dö på grund av cancer cirka 25 % för en 25-årig patient. För varje Sv ökar risken att inducera cancer med 5 % jämfört med den totala risken i befolkningen. Vid exponering av en stråldos på 28 mSv = 0,028 (0,03) ökar risken med 5 % * 0,03 = 0,2 % efter deltagande i studien. Risken är dock åldersberoende och på grund av de nationella riktlinjerna [27] kan det aktuella projektet betraktas som ett forskningsprojekt i kategori IIb, eftersom alla patienter kommer att vara över 50 år. För att ett forskningsprojekt av denna kategori ska godkännas bör fördelarna med projektet förväntas vara "inriktade mot diagnostik, bot eller förebyggande av sjukdom" - vilket är exakt fallet för den aktuella studien. Den ökade risken på grund av strålning måste hållas upp mot den potentiella nyttan för patienten som deltar i studien och för framtida patienter. Den potentiella fördelen för patienten som deltar i studien är framför allt en möjligen bättre stadieindelning av sjukdomen. Dessutom, om studien på lymfkörtlar visar trender mot användbarhet för att upptäcka lymfkörtelmetastaser, kan detta vara till stor nytta för framtida patienter.

Etiska överväganden som gäller i KIDSTAGE II och III: När vi bestämmer DNA-sekvensen för hela arvsmassan finns en liten risk att hitta genetiska defekter i arvsmassan. Vissa genetiska defekter kan orsaka ärftliga sjukdomar och kan påverka hälsan hos patienten och patientens familj. I vissa fall är det möjligt att behandla eller till och med förebygga sjukdomen som orsakas av den gendefekten och i andra fall inte. I den skriftliga information som patienten får kommer denna risk att nämnas och patienten får möjlighet att bestämma hur mycket information man vill veta om sitt eget genetiska material. I situationer där vi hittar en defekt i arvsmassan som kan orsaka sjukdom på lång sikt, och där patienten velat bli informerad, kommer patienten att kallas till intervju på kliniken. Under denna intervju kommer det att finnas en genetisk rådgivare närvarande. Den genetiska rådgivaren kommer att informera patienten om vad informationen betyder för patienten och patientens familj.

Ovannämnda studier (Projekt-ID S-20160005), patientinformationsbladen och formuläret för informerat samtycke godkändes av Regionala Scientific Ethical Committees for Southern Denmark den 4 februari 2016 och av den lokala dataskyddsmyndigheten "Datatilsynet" i oktober 2016 med professor MD Lars Lund som huvudhandledare för doktoranden Louise Geertsen. Försöket kommer att genomföras i enlighet med Good Clinical Practice, Helsingforsdeklarationen.