棉签和牙刷清洁机械通气患者牙齿的比较

研究目标：这项工作的主要目的是确定泡沫拭子或牙刷是否提供最有效的口腔插管机械通气患者牙菌斑清除方法。

次要目标是分析牙菌斑、气管插管和肺中的微生物菌群。 此外，收集斑块样本、用过的气管插管 (ETT) 和非定向支气管肺泡灌洗 (NBL) 将使我们能够确定口腔微生物是否有助于 ETT 内生物膜的形成并可能促进 VAP。 这项研究的结果不仅会增加我们对参与促进 ETT 生物膜的生物体的认识，而且还可能突出减少其形成的潜在管理策略。

研究人群：入住加的夫威尔士大学医院重症监护病房的危重成年患者，他们已经开始机械通气。

招募：所有满足纳入和排除标准、从研究开始之日起入住威尔士大学医院成人 ICU 的患者将被视为符合招募条件。 值班顾问确定的患者将被通知研究团队。 将获得同意，总共将招募 50 名患者。

干预：这是一项分口设计研究，其中在嘴的一侧进行干预（用泡沫棉签或牙刷清洁）。 例如，嘴巴左侧的泡沫棉签和嘴巴右侧的牙刷。 清洁将每天进行至少 24 小时或直到拔管或招募后最多 7 天，以较短者为准。

非定向支气管肺泡灌洗 (NBLs) 将在周一和周四以及有临床指征（例如疑似 VAP）时进行。 这包括将无菌抽吸导管插入肺部，滴注 10-20ml 无菌生理盐水并抽回，然后放置在无菌通用容器中。 当有疑似感染时，样本将被分成两份，一半像往常一样去 UHW 微生物学实验室，另一半将作为研究的一部分进行分析。 如果没有疑似感染，所有样本都将作为研究的一部分进行分析。

方法：招募后，患者将使用“婴儿牙刷”和泡沫棉签每天两次用无菌水清洁牙齿 2 分钟，清洁方法分配到的一侧将被随机分配。 分配给口腔两侧的清洁时间为一分钟。

在清洁之前记录修改后的 Silness 和 Loe 菌斑评分（Scannapieco 等人，1992 年）和牙龈指数（Loe 和 Silness，1963 年），然后在整个研究期间每天早上清洁后记录。 牙菌斑指数将从颊面记录在口腔两侧的上下第一磨牙、第一双尖牙和中切牙。 牙菌斑指数得分将是每侧六颗牙齿的平均值。 对于缺失指数牙的患者，将对最接近的剩余牙齿进行评分。 牙龈指数将在同一颗牙齿上进行评分。

记录牙菌斑和牙龈指数后，将在用于牙菌斑评分的同一颗牙齿上收集牙菌斑样本。 然后在开始口腔护理之前使用无菌刮匙从目标牙齿的牙龈第三部分收集龈上菌斑样本，然后在清洁前每天一次。 立即将噬菌斑接种到 1ml 微生物转运培养基中。 在使用螺旋平板系统（Don Whitley Scientific）接种琼脂平板之前，将在磷酸盐缓冲盐水中以连续十进制方式稀释传输介质。 以下琼脂将用于培养微生物：血琼脂（需氧菌）、Fastidious Anaerobe Agar（厌氧菌）和科玛嘉念珠菌（念珠菌和酵母菌种）。 乳糖发酵肠道细菌的差异计数将通过使用 MacConkey 琼脂进行，而葡萄球菌种类（凝固酶阳性和凝固酶阴性）将使用甘露醇盐琼脂 (MSA) 进行检测。 接种的培养基将在 37°C 的适当气体环境下孵育 48 小时（需氧菌）或 7 天（厌氧菌）。 从血琼脂上获得每一侧的总需氧微生物计数，并表示为总菌落形成单位 (CFU)。

每个不同的菌落形态类型的鉴定将通过广泛的表型调查。 测试将涉及革兰氏染色、氧化酶和过氧化氢酶活性以及通过一系列测试系统进行的生化分析。 生化测试系统将包括 APICoryne 系统（革兰氏阳性杆菌）、APIStrep 系统（过氧化氢酶阴性革兰氏阳性球菌）、APIStaph 和 ID32Staph（过氧化氢酶阳性革兰氏阳性球菌）。 氧化酶阴性、革兰氏阴性杆菌将使用 API20E 测试进行分析，而氧化酶阳性革兰氏阴性杆菌将使用 API NE 进行分析。 真菌生物体（念珠菌和酵母菌种）将根据菌落颜色和在差异培养基 CHROMagar 上的外观以及使用 Auxocolour 2 系统 (biorad) 的生化分析进行鉴定。

如上文干预部分所述收集 NBL。 NBL 样品中存在的生物体的鉴定将使用上述培养方法进行。

如果患者在研究期间拔管，则气管插管将被收集并转移到实验室。 ETT 的处理将涉及将每个管分成多个部分，以便通过微生物培养、分子分析或显微成像对生物体进行定量鉴定。

每个 ETT 的部分最初将被放置在 2 ml 磷酸盐缓冲盐水中，涡流与灭菌玻璃珠混合 30 秒以破坏生物膜聚集体。 然后去除 PBS 溶液并按十进制连续稀释 106 倍。

生物膜中存在的生物体的鉴定将使用上述培养方法以及补充分子分析（如下所述）来完成。

16S 核糖体 RNA 基因定义的气管插管细菌污染 回收的气管插管每个区域的切片将使用分子程序进行分析。 该方法将涉及使用 Puregene™ 细菌 DNA 分离试剂盒 (Gentra Systems) 从 500 µl 标本中提取总 DNA。 通用细菌引物对 d88 和 e94（Paster 等人，2001 年）和目标生物特异引物（牙龈卟啉单胞菌、变形链球菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌）随后将用于扩增提取样品中的 16S rRNA 基因目标，使用标准 PCR 和反应条件。 阴性对照将包括试剂对照（无菌水作为 PCR 模板）和样品制备对照（无菌水代替原始样品并暴露于整个提取方案）。 来自已知牙龈卟啉菌、金黄色葡萄球菌和变异菌的模板 DNA 的阳性对照也将包括在内。

共聚焦激光扫描显微镜 所用 ETT 的切片也将使用生物体特异性肽核酸 (PNA) 探针进行荧光原位杂交分析。 每个特定探针将与不同的荧光标记结合，以允许目标生物（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、变形链球菌）在 ETT 生物膜内的空间定位和分布。

其他数据的收集：将记录患者的基线人口统计数据，包括年龄、性别、APACHE II 评分、合并症、入院天数和最近的抗生素使用情况。

牙科保健员将在研究期间记录 Zsigmondy 和 DMFT（蛀牙、缺牙、补牙）评分，以评估登记患者的基线牙齿状况。

结果测量：主要结果：机械清洁后的每日牙菌斑和牙龈评分，以及牙菌斑内细菌的鉴定和量化。 定量比较将从两种清洁方法的总对数转换 CFU 计数和菌斑和牙龈评分中确定。