Porównanie wacików i szczoteczek do zębów w czyszczeniu zębów pacjentów wentylowanych mechanicznie

Cel badania: Głównym celem tej pracy jest określenie, czy waciki czy szczoteczki do zębów są najskuteczniejszą metodą usuwania płytki nazębnej u zaintubowanych ustnie pacjentów wentylowanych mechanicznie.

Drugim celem jest profilowanie flory bakteryjnej płytki nazębnej, rurki dotchawiczej i płuca. Ponadto pobranie obu próbek płytki nazębnej, zużytych rurek dotchawiczych (ETT) oraz niekierowanego płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (NBL) pozwoli nam określić, czy mikroorganizmy jamy ustnej przyczyniają się do tworzenia biofilmu w ETT i potencjalnie sprzyjają VAP. Wyniki tego badania nie tylko poszerzą naszą wiedzę na temat organizmów zaangażowanych w promowanie biofilmów na ETT, ale mogą również uwypuklić potencjalne strategie zarządzania w celu ograniczenia ich powstawania.

Badana populacja: Krytycznie chorzy dorośli pacjenci przyjęci na oddział intensywnej terapii w Szpitalu Uniwersyteckim w Walii w Cardiff, u których rozpoczęto wentylację mechaniczną.

Rekrutacja: Wszyscy pacjenci spełniający kryteria włączenia i wyłączenia, przyjęci na oddział intensywnej terapii dla dorosłych w Walijskim Szpitalu Uniwersyteckim od daty rozpoczęcia badania, zostaną uznani za kwalifikujących się do rekrutacji. Pacjenci zidentyfikowani przez konsultanta dyżurnego zostaną powiadomieni o zespole badawczym. Uzyskana zostanie zgoda i łącznie zrekrutowanych zostanie 50 pacjentów.

Interwencje: Jest to badanie z rozszczepionymi ustami, w którym interwencja (czyszczenie piankowym wacikiem lub szczoteczką do zębów) jest wykonywana po jednej stronie ust. Na przykład wacik z lewej strony jamy ustnej i szczoteczka do zębów z prawej strony jamy ustnej. Czyszczenie będzie wykonywane codziennie przez co najmniej 24 godziny lub do ekstubacji lub do siedmiu dni po rekrutacji, w zależności od tego, który z tych okresów jest krótszy.

Niekierowane płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (NBL) będzie wykonywane w poniedziałki i czwartki oraz w przypadku wskazań klinicznych (np. podejrzenie VAP). Polega to na wprowadzeniu sterylnego cewnika do odsysania do płuc, wkropleniu i odessaniu 10-20 ml sterylnej soli fizjologicznej oraz umieszczeniu w sterylnym pojemniku uniwersalnym. Próbka zostanie podzielona na dwie części, gdy pojawi się podejrzenie infekcji, jedna połowa trafi jak zwykle do laboratorium mikrobiologicznego UHW, a druga połowa zostanie profilowana w ramach badania. Jeśli nie ma podejrzenia zakażenia, cała próbka zostanie sprofilowana jako część badania.

Metody: Po rekrutacji pacjenci będą mieli zęby czyszczone dwa razy dziennie sterylną wodą przez 2 minuty przy użyciu „dziecięcej szczoteczki do zębów” i wacika, strona, do której przypisana jest metoda czyszczenia, zostanie wybrana losowo. Jedna minuta czyszczenia przypisana do każdej strony ust.

Zmodyfikowany wskaźnik płytki nazębnej Silness i Loe (Scannapieco i wsp. 1992) oraz indeks dziąseł (Loe i Silness 1963) będą rejestrowane przed czyszczeniem, a następnie każdego ranka po czyszczeniu przez cały czas trwania badania. Wskaźnik płytki zostanie odnotowany na górnych i dolnych pierwszych zębach trzonowych, pierwszych przedtrzonowych i centralnych siekaczach po każdej stronie jamy ustnej od powierzchni policzkowej. Wynik wskaźnika płytki nazębnej będzie średnią z sześciu zębów po każdej stronie. W przypadku pacjentów z brakującymi zębami wskazującymi zostaną ocenione pozostałe zęby w najbliższym sąsiedztwie. Wskaźnik dziąseł zostanie oceniony na tych samych zębach.

Po zarejestrowaniu płytki nazębnej i wskaźnika dziąseł próbki płytki nazębnej zostaną pobrane z tych samych zębów, które zostały użyte do oceny płytki nazębnej. Próbki płytki nazębnej naddziąsłowej będą następnie pobierane z trzeciej części dziąsłowej docelowych zębów za pomocą sterylnej łyżeczki przed rozpoczęciem pielęgnacji jamy ustnej, a następnie raz dziennie przed czyszczeniem. Płytkę należy natychmiast zaszczepić w 1 ml mikrobiologicznej pożywki transportowej. Pożywka transportowa zostanie rozcieńczona w sposób szeregowy po przecinku w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami przed inokulacją płytek agarowych przy użyciu spiralnego systemu posiewu (Don Whitley Scientific). Do hodowli mikroorganizmów zostaną użyte następujące agary: Blood Agar (bakterie tlenowe), Fastidious Anaerobe Agar (bakterie beztlenowe) oraz CHROMagar Candida (gatunki Candida i drożdże). Zróżnicowanie liczby bakterii jelitowych fermentujących laktozę zostanie przeprowadzone na podłożu MacConkey Agar, podczas gdy gatunki Staphylococcus (koagulazo-dodatnie i koagulazo-ujemne) zostaną wykryte na podłożu Mannitol Salt Agar (MSA). Zaszczepiona pożywka będzie inkubowana w odpowiednim środowisku gazowym w temperaturze 37°C przez 48 godzin (tlenowce) lub 7 dni (beztlenowce). Całkowita liczba drobnoustrojów tlenowych z każdej strony zostanie uzyskana z agarów z krwią i wyrażona jako całkowita liczba jednostek tworzących kolonie (CFU).

Identyfikacja każdego odrębnego morfotypu kolonii będzie polegała na szeroko zakrojonych badaniach fenotypowych. Testy obejmą barwienie metodą Grama, aktywność oksydazy i katalazy oraz profilowanie biochemiczne za pomocą szeregu systemów testowych. Systemy testów biochemicznych będą obejmowały system APICoryne (bakterie Gram-dodatnie), system APIStrep (ziarniaki Gram-dodatnie ujemne pod względem katalazy), APIStaph i ID32Staph (ziarniaki Gram-dodatnie katalazo-dodatnie). Oksydazo-ujemne, Gram-ujemne pałeczki będą profilowane przy użyciu testu API20E, podczas gdy oksydazo-dodatnie pałeczki Gram-ujemne będą profilowane przy użyciu API NE. Organizmy grzybicze (gatunki Candida i drożdże) zostaną zidentyfikowane na podstawie koloru i wyglądu kolonii na podłożu różnicującym CHROMagar oraz poprzez profilowanie biochemiczne w systemie Auxocolour 2 (biorad).

NBL zebrane zgodnie z opisem w sekcji dotyczącej interwencji powyżej. Identyfikacja organizmów obecnych w próbkach NBL zostanie przeprowadzona przy użyciu metod hodowlanych opisanych powyżej.

Jeśli pacjenci zostaną ekstubowani podczas badania, rurka dotchawicza zostanie pobrana i przeniesiona do laboratorium. Przetwarzanie ETT będzie obejmować podzielenie każdej probówki na sekcje w celu ilościowej identyfikacji organizmów za pomocą hodowli drobnoustrojów, analizy molekularnej lub obrazowania mikroskopowego.

Skrawki każdej rurki dotchawiczej początkowo umieszcza się w 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i miesza na worteksie przez 30 s ze sterylizowanymi kulkami szklanymi w celu rozbicia agregatów biofilmu. Roztwór PBS zostanie następnie usunięty i rozcieńczony seryjnie dziesiętnie, 106-krotnie.

Identyfikacja organizmów obecnych w biofilmach zostanie przeprowadzona przy użyciu metod hodowlanych opisanych powyżej wraz z uzupełniającą analizą molekularną (opisaną poniżej).

Zanieczyszczenie bakteryjne rurek dotchawiczych określone przez gen rybosomalny RNA 16S Skrawki z każdego regionu odzyskanych rurek dotchawiczych zostaną przeanalizowane przy użyciu procedur molekularnych. Metoda obejmuje ekstrakcję całkowitego DNA z 500 µl próbek przy użyciu zestawu do izolacji bakteryjnego DNA Puregene™ (Gentra Systems). Uniwersalne pary starterów bakteryjnych, d88 i e94 (Paster i in., 2001) oraz startery specyficzne dla organizmów docelowych (Porphyromonas gingivalis, Streptococcus mutans, Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus) zostaną następnie użyte do amplifikacji docelowych genów 16S rRNA w wyekstrahowanych próbkach przy użyciu standardowe warunki PCR i reakcji. Kontrole ujemne obejmują kontrolę odczynników (sterylna woda jako matryca do PCR) oraz kontrolę przygotowania próbki (sterylna woda używana zamiast oryginalnej próbki i poddana działaniu całego protokołu ekstrakcji). Uwzględnione zostaną również pozytywne kontrole wzorcowego DNA ze znanych gatunków P. gingivalis, S. aureus i mutans.

Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa Wycinki użytego ETT zostaną również przeanalizowane przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ przy użyciu specyficznych dla organizmu sond z kwasem peptydonukleinowym (PNA). Każda specyficzna sonda będzie sprzężona z odrębnym znacznikiem fluorescencyjnym, aby umożliwić lokalizację przestrzenną i rozmieszczenie organizmów docelowych (S. aureus, P. aeruginosa, Candida albicans, S. mutans) w biofilmie ETT.

Zbieranie innych danych: Zostaną zarejestrowane podstawowe dane demograficzne pacjentów, w tym wiek, płeć, wynik APACHE II, choroby współistniejące, dni od przyjęcia do szpitala i ostatnie podanie antybiotyku.

Podczas badania higienistka dentystyczna zapisze wynik Zsigmondy i DMFT (zepsute, brakujące, wypełnione zęby) w celu oceny wyjściowego stanu uzębienia włączonych pacjentów.

Miary wyniku: Główny wynik: Codzienna ocena płytki nazębnej i dziąseł po czyszczeniu mechanicznym, z identyfikacją i oceną ilościową bakterii w płytce nazębnej. Porównania ilościowe zostaną przeprowadzone na podstawie całkowitej przekształconej logarytmicznie liczby CFU oraz oceny płytki nazębnej i dziąseł z dwóch metod czyszczenia.