Confronto tra tamponi e spazzolini da denti nella pulizia dei denti di pazienti ventilati meccanicamente

Obiettivo dello studio: Lo scopo principale di questo lavoro è determinare se i tamponi di schiuma o gli spazzolini da denti offrono il metodo più efficace per rimuovere la placca dentale nei pazienti intubati per via orale e ventilati meccanicamente.

L'obiettivo secondario è quello di profilare la flora microbiologica nella placca dentale, nel tubo endotracheale e nel polmone. Inoltre, la raccolta di entrambi i campioni di placca, tubi endotracheali usati (ETT) e lavaggio broncoalveolare non diretto (NBL) ci consentirà di determinare se i microrganismi orali contribuiscono alla formazione di biofilm all'interno dell'ETT e potenzialmente promuovono la VAP. I risultati di questo studio non solo miglioreranno le nostre conoscenze sugli organismi coinvolti nella promozione dei biofilm su ETT, ma potrebbero anche evidenziare potenziali strategie di gestione per ridurne la formazione.

Popolazione in studio: pazienti adulti in condizioni critiche ricoverati presso l'unità di terapia intensiva presso l'University Hospital of Wales, Cardiff, nei quali è stata avviata la ventilazione meccanica.

Reclutamento: tutti i pazienti che soddisfano i criteri di inclusione ed esclusione, ammessi all'ICU per adulti presso l'University Hospital of Wales dalla data di inizio dello studio saranno considerati idonei per il reclutamento. I pazienti individuati dal consulente di turno saranno notificati al gruppo di ricerca. Si otterrà il consenso e in totale verranno reclutati 50 pazienti.

Interventi: si tratta di uno studio di progettazione della bocca divisa in cui l'intervento (pulizia con un tampone di schiuma o uno spazzolino da denti) viene eseguito su un lato della bocca. Ad esempio un tampone di gommapiuma sul lato sinistro della bocca e uno spazzolino da denti sul lato destro della bocca. La pulizia verrà eseguita quotidianamente per un minimo di 24 ore o fino all'estubazione o fino a sette giorni dopo il reclutamento, a seconda di quale sia il più breve.

I lavaggi broncoalveolari non diretti (NBL) verranno eseguiti il ​​lunedì e il giovedì e quando clinicamente indicato (ad esempio un sospetto VAP). Ciò comporta l'inserimento di un catetere di aspirazione sterile nel polmone, 10-20 ml di soluzione salina sterile vengono instillati e ritirati e posti in un universale sterile. Il campione verrà diviso in due in caso di sospetta infezione, metà andrà al laboratorio di microbiologia UHW come di consueto, l'altra metà verrà profilata come parte dello studio. Se non vi è alcuna sospetta infezione, tutto il campione verrà profilato come parte dello studio.

Metodi: dopo il reclutamento, ai pazienti verranno puliti i denti due volte al giorno con acqua sterile per 2 minuti utilizzando uno "spazzolino da denti per bambini" e un tampone di schiuma, il lato a cui è assegnato il metodo di pulizia sarà randomizzato. Un minuto di pulizia assegnato a ciascun lato della bocca.

Un punteggio di placca modificato di Silness e Loe (Scannapieco et al 1992) e un indice gengivale (Loe e Silness 1963) saranno registrati prima della pulizia e poi ogni mattina dopo la pulizia per tutta la durata dello studio. L'indice di placca verrà registrato sui primi molari superiori e inferiori, sui primi premolari e sugli incisivi centrali su ciascun lato della bocca dalla superficie buccale. Il punteggio dell'indice di placca sarà una media dei sei denti su ciascun lato. Per i pazienti con denti indice mancanti, verranno conteggiati i denti rimanenti nelle immediate vicinanze. L'indice gengivale verrà segnato sugli stessi denti.

Dopo la registrazione della placca e dell'indice gengivale, i campioni di placca saranno raccolti sugli stessi denti utilizzati per il punteggio della placca. Campioni di placca sopragengivale verranno quindi raccolti dalla terza porzione gengivale dei denti mirati utilizzando una curette sterile prima dell'inizio della cura orale e poi una volta al giorno prima della pulizia. La placca verrà immediatamente inoculata in 1 ml di mezzo di trasporto microbiologico. Il terreno di trasporto sarà diluito in modo decimale seriale in soluzione salina tamponata con fosfato prima dell'inoculazione delle piastre di agar utilizzando un sistema di placcatura a spirale (Don Whitley Scientific). Per la coltura dei microrganismi verranno utilizzati i seguenti agar: Blood Agar (batteri aerobici), Fastidious Anaerobe Agar (batteri anaerobi) e CHROMagar Candida (specie Candida e lieviti). Le conte differenziali dei batteri enterici fermentanti il ​​lattosio saranno effettuate mediante l'uso di MacConkey Agar, mentre le specie Staphylococcus (coagulasi positive e coagulasi negative) saranno rilevate mediante Mannitol Salt Agar (MSA). I terreni inoculati saranno incubati in ambienti gassosi appropriati a 37°C per 48 ore (aerobi) o 7 giorni (anaerobi). Una conta microbica aerobica totale da ciascun lato sarà ottenuta dagli agar sangue ed espressa come unità formanti colonie (CFU) totali.

L'identificazione di ogni distinto morfotipo di colonia avverrà attraverso un'ampia indagine fenotipica. I test riguarderanno la colorazione di Gram, l'attività dell'ossidasi e della catalasi e il profilo biochimico attraverso una gamma di sistemi di test. I sistemi di test biochimici includeranno il sistema APICoryne (bacilli Gram-positivi), il sistema APIStrep (cocchi Gram-positivi catalasi-negativi), APIStaph e ID32Staph (cocchi Gram-positivi catalasi-positivi). I bacilli Gram-negativi ossidasi-negativi saranno profilati utilizzando il test API20E mentre i bacilli Gram-negativi ossidasi-positivi saranno profilati utilizzando l'API NE. Gli organismi fungini (specie Candida e lievito) saranno identificati in base al colore e all'aspetto della colonia sul terreno differenziale, CHROMagar e mediante profili biochimici con il sistema Auxocolour 2 (biorad).

NBL raccolti come descritto nella sezione sugli interventi di cui sopra. L'identificazione dei microrganismi presenti all'interno dei campioni di NBL sarà effettuata utilizzando i metodi colturali descritti sopra.

Se i pazienti vengono estubati durante lo studio, il tubo endotracheale verrà prelevato e trasferito al laboratorio. L'elaborazione dell'ETT comporterà la divisione di ciascuna provetta in sezioni per l'identificazione quantitativa degli organismi mediante coltura microbica, analisi molecolare o imaging microscopico.

Le sezioni di ciascun ETT saranno inizialmente poste in 2 ml di soluzione salina tamponata con fosfato e miscelate su vortex per 30 s con biglie di vetro sterilizzate per distruggere gli aggregati del biofilm. La soluzione PBS verrà quindi rimossa e diluita serialmente in modo decimale, 106 volte.

L'identificazione degli organismi presenti all'interno dei biofilm sarà effettuata utilizzando i metodi colturali descritti sopra, insieme all'analisi molecolare supplementare (descritta di seguito).

Contaminazione batterica dei tubi endotracheali definita dal gene dell'RNA ribosomiale 16S Le sezioni di ciascuna regione dei tubi endotracheali recuperati saranno analizzate utilizzando procedure molecolari. Il metodo prevede l'estrazione del DNA totale da 500 µl di campioni utilizzando un kit di isolamento del DNA batterico Puregeneâ (Gentra Systems). Coppie di primer batterici universali, d88 ed e94 (Paster et al, 2001) e primer specifici per organismi bersaglio (Porphyromonas gingivalis, Streptococcus mutans, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus) saranno quindi utilizzati per amplificare i bersagli del gene 16S rRNA all'interno dei campioni estratti utilizzando PCR standard e condizioni di reazione. I controlli negativi includeranno un controllo del reagente (acqua sterile come modello PCR) e un controllo della preparazione del campione (acqua sterile utilizzata al posto del campione originale ed esposta all'intero protocollo di estrazione). Saranno inclusi anche controlli positivi di DNA stampo da specie note di P. gingivalis, S. aureus e mutans.

Microscopia confocale a scansione laser Sezioni dell'ETT utilizzato saranno anche analizzate utilizzando l'ibridazione in situ fluorescente utilizzando sonde di acido nucleico peptidico (PNA) specifiche dell'organismo. Ogni sonda specifica sarà coniugata con un marcatore fluorescente distinto per consentire la localizzazione spaziale e la distribuzione degli organismi bersaglio (S. aureus, P. aeruginosa, Candida albicans, S. mutans) all'interno del biofilm ETT.

Raccolta di altri dati: verranno registrati i dati demografici di base dei pazienti, inclusi età, sesso, punteggio APACHE II, comorbilità, giorni dal ricovero ospedaliero e recente somministrazione di antibiotici.

Un punteggio Zsigmondy e DMFT (denti cariati, mancanti, pieni) sarà registrato da un igienista dentale durante lo studio per valutare lo stato dentale di base dei pazienti arruolati.

Misure di risultato: Risultato primario: placca giornaliera e punteggi gengivali dopo la pulizia meccanica, con identificazione e quantificazione dei batteri all'interno della placca. I confronti quantitativi saranno accertati dai conteggi di CFU trasformati in logaritmi totali e dai punteggi di placca e gengiva dai due metodi di pulizia.