Vergelijking van wattenstaafjes en tandenborstels bij het reinigen van de tanden van mechanisch beademde patiënten

Studiedoel: Het hoofddoel van dit werk is om te bepalen of schuimrubberen wattenstaafjes of tandenborstels de meest effectieve methode zijn om tandplak te verwijderen bij oraal geïntubeerde, mechanisch beademde patiënten.

Het secundaire doel is het profileren van de microbiologische flora in tandplak, endotracheale tube en long. Bovendien zal het verzamelen van beide plaquemonsters, gebruikte endotracheale buizen (ETT's) en niet-gerichte bronchoalveolaire lavage (NBL) ons in staat stellen te bepalen of orale micro-organismen bijdragen aan biofilmvorming binnen de ETT en mogelijk VAP bevorderen. De bevindingen van deze studie zullen niet alleen onze kennis vergroten over de organismen die betrokken zijn bij het bevorderen van biofilms op ETT, maar kunnen ook potentiële beheerstrategieën benadrukken om hun vorming te verminderen.

Studiepopulatie: Ernstig zieke volwassen patiënten die zijn opgenomen op de intensive care-afdeling van het Universitair Ziekenhuis van Wales, Cardiff, bij wie mechanische beademing is gestart.

Werving: Alle patiënten die voldoen aan de in- en uitsluitingscriteria en vanaf de startdatum van het onderzoek zijn opgenomen op de IC voor volwassenen van het Universitair Ziekenhuis van Wales, komen in aanmerking voor werving. Patiënten geïdentificeerd door de dienstdoende consulent worden aangemeld bij het onderzoeksteam. Er zal toestemming worden verkregen en in totaal zullen 50 patiënten worden geworven.

Interventies: Dit is een split mouth design studie waarbij de ingreep (reinigen met een schuimrubberen wattenstaafje of tandenborstel) aan één kant van de mond wordt uitgevoerd. Bijvoorbeeld een schuimrubberen wattenstaafje aan de linkerkant van de mond en een tandenborstel aan de rechterkant van de mond. Reiniging wordt dagelijks uitgevoerd gedurende minimaal 24 uur of tot extubatie of tot zeven dagen na rekrutering, afhankelijk van wat de kortste is.

Niet-gerichte bronchoalveolaire lavages (NBL's) worden op maandag en donderdag genomen en wanneer dit klinisch geïndiceerd is (bijvoorbeeld bij verdenking op VAP). Dit omvat het inbrengen van een steriele zuigkatheter in de long, 10-20 ml steriele zoutoplossing wordt ingebracht en teruggetrokken en in een steriele universele geplaatst. Het monster wordt in tweeën gesplitst wanneer er een vermoedelijke infectie is, de ene helft gaat zoals gewoonlijk naar het UHW-microbiologisch laboratorium, de andere helft wordt geprofileerd als onderdeel van het onderzoek. Als er geen vermoedelijke infectie is, wordt het hele monster geprofileerd als onderdeel van het onderzoek.

Methoden: Na de werving wordt het gebit van patiënten twee keer per dag gedurende 2 minuten gereinigd met steriel water met behulp van een 'babytandenborstel' en een schuimrubberen wattenstaafje. Aan welke kant de reinigingsmethode wordt toegewezen, wordt gerandomiseerd. Eén minuut reiniging toegewezen aan elke kant van de mond.

Een aangepaste Silness- en Loe-plaquescore (Scannapieco et al. 1992) en tandvleesindex (Loe en Silness 1963) zullen voorafgaand aan het schoonmaken worden geregistreerd en vervolgens elke ochtend na het schoonmaken gedurende de duur van het onderzoek. De plaque-index wordt geregistreerd op de bovenste en onderste eerste molaren, eerste bicuspide en centrale snijtanden aan elke kant van de mond vanaf het buccale oppervlak. De plaque-indexscore is een gemiddelde van de zes tanden aan elke kant. Voor patiënten met ontbrekende wijstanden worden de resterende tanden die het dichtst bij elkaar liggen gescoord. De tandvleesindex wordt op dezelfde tanden gescoord.

Na registratie van de plaque en de gingivale index worden plaquemonsters verzameld op dezelfde tanden als gebruikt voor de plaquescore. Monsters van supragingivale plaque worden vervolgens verzameld uit het derde deel van het tandvlees van de beoogde tanden met behulp van een steriele curette voorafgaand aan de start van de mondverzorging en vervolgens eenmaal per dag vóór het reinigen. Plaque wordt onmiddellijk geïnoculeerd in 1 ml microbiologisch transportmedium. Het transportmedium zal worden verdund op een seriële decimale manier in fosfaatgebufferde zoutoplossing voorafgaand aan inoculatie van agarplaten met behulp van een spiraalvormig plaatsysteem (Don Whitley Scientific). De volgende agars zullen worden gebruikt om de micro-organismen te kweken: Blood Agar (aerobe bacteriën), Fastidious Anaerobe Agar (anaerobe bacteriën) en CHROMagar Candida (Candida en gistsoorten). Differentiële tellingen van lactose-fermenterende darmbacteriën zullen worden uitgevoerd door middel van MacConkey-agar, terwijl Staphylococcus-soorten (coagulase-positief en coagulase-negatief) zullen worden gedetecteerd met behulp van mannitol-zoutagar (MSA). De geïnoculeerde media worden geïncubeerd onder geschikte gasvormige omgevingen bij 37°C gedurende 48 uur (aeroben) of 7 dagen (anaëroben). Een totale aerobe microbiële telling van elke kant zal worden verkregen uit de bloed-agars en uitgedrukt als totale kolonievormende eenheden (CFU's).

Identificatie van elk afzonderlijk koloniemorfotype zal plaatsvinden door middel van uitgebreid fenotypisch onderzoek. Tests omvatten Gram-kleuring, oxidase- en catalase-activiteit en biochemische profilering door middel van een reeks testsystemen. De biochemische testsystemen omvatten het APICoryne-systeem (Gram-positieve bacillen), APIStrep-systeem (catalase-negatieve Gram-positieve kokken), APIStaph en ID32Staph (catalase-positieve Gram-positieve kokken). Oxidase-negatieve, Gram-negatieve bacillen worden geprofileerd met behulp van de API20E-test, terwijl oxidase-positieve Gram-negatieve bacillen worden geprofileerd met behulp van de API NE. Schimmelorganismen (Candida en gistsoorten) zullen worden geïdentificeerd op basis van koloniekleur en uiterlijk op het differentiële medium, CHROMagar, en door biochemische profilering met het Auxocolour 2-systeem (biorad).

NBL's verzameld zoals beschreven in het gedeelte over interventies hierboven. Identificatie van de organismen die aanwezig zijn in de NBL-monsters zal worden gedaan met behulp van de hierboven beschreven culturele methoden.

Als patiënten tijdens het onderzoek worden geëxtubeerd, wordt de endotracheale tube verzameld en overgebracht naar het laboratorium. De verwerking van ETT omvat het verdelen van elke buis in secties voor kwantitatieve identificatie van organismen door microbiële kweek, moleculaire analyse of microscopische beeldvorming.

Secties van elke ETT worden in eerste instantie in 2 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing geplaatst en vortex gedurende 30 seconden gemengd met gesteriliseerde glasparels om biofilmaggregaten te verstoren. De PBS-oplossing wordt vervolgens verwijderd en serieel decimaal verdund, 106-voudig.

Identificatie van de organismen die in de biofilms aanwezig zijn, zal worden gedaan met behulp van de hierboven beschreven culturele methoden, samen met aanvullende moleculaire analyse (hieronder beschreven).

16S ribosomaal RNA gen-gedefinieerde bacteriële verontreiniging van endotracheale buizen Secties van elk gebied van herstelde endotracheale buizen zullen worden geanalyseerd met behulp van moleculaire procedures. De methode omvat de extractie van totaal DNA uit 500 µl van de monsters met behulp van een Puregene™ bacteriële DNA-isolatiekit (Gentra Systems). Universele bacteriële primerparen, d88 en e94 (Paster et al, 2001) en primers die specifiek zijn voor doelorganismen (Porphyromonas gingivalis, Streptococcus mutans, Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus) zullen vervolgens worden gebruikt om de 16S rRNA-gendoelen in de geëxtraheerde monsters te amplificeren met behulp van standaard PCR en reactieomstandigheden. Negatieve controles omvatten een reagenscontrole (steriel water als PCR-template) en een monstervoorbereidingscontrole (steriel water gebruikt in plaats van het oorspronkelijke monster en blootgesteld aan het volledige extractieprotocol). Positieve controles van template-DNA van bekende soorten van P. gingivalis, S. aureus en mutans zullen ook worden opgenomen.

Confocale laser scanning microscopie Delen van de gebruikte ETT zullen ook worden geanalyseerd met behulp van fluorescerende in situ hybridisatie met behulp van organismespecifieke Peptide Nucleic Acid (PNA) probes. Elke specifieke sonde zal worden geconjugeerd met een duidelijk fluorescerend label om ruimtelijke locatie en verdeling van doelorganismen (S. aureus, P. aeruginosa, Candida albicans, S. mutans) binnen de ETT-biofilm mogelijk te maken.

Verzameling van andere gegevens: Baseline demografische gegevens van patiënten zullen worden geregistreerd, inclusief leeftijd, geslacht, APACHE II-score, comorbiditeiten, dagen vanaf ziekenhuisopname en recente toediening van antibiotica.

Een Zsigmondy- en DMFT-score (rotte, ontbrekende, gevulde tanden) zal tijdens het onderzoek door een mondhygiënist worden geregistreerd om de basisstatus van de tandheelkundige status van de ingeschreven patiënten te beoordelen.

Uitkomstmaten: Primaire uitkomst: Dagelijkse plaque- en tandvleesscores na mechanische reiniging, met identificatie en kwantificering van bacteriën in plaque. Kwantitatieve vergelijkingen zullen worden vastgesteld op basis van de totale log-getransformeerde CFU-tellingen en plaque- en tandvleesscores van de twee reinigingsmethoden.