Comparação de cotonetes e escovas de dentes na limpeza dos dentes de pacientes ventilados mecanicamente

Objetivo do estudo: O objetivo principal deste trabalho é determinar se cotonetes de espuma ou escovas de dentes oferecem o método mais eficaz de remoção de placa bacteriana em pacientes com ventilação mecânica intubados por via oral.

O objetivo secundário é traçar o perfil da flora microbiológica na placa dental, tubo endotraqueal e pulmão. Além disso, a coleta de amostras de placa, tubos endotraqueais (ETTs) usados ​​e lavagem broncoalveolar não direcionada (NBL) nos permitirá determinar se os microrganismos orais contribuem para a formação de biofilme dentro do ETT e potencialmente promovem PAV. As descobertas deste estudo não apenas aumentarão nosso conhecimento sobre os organismos envolvidos na promoção de biofilmes no ETT, mas também poderão destacar estratégias de gerenciamento em potencial para reduzir sua formação.

População do estudo: Pacientes adultos criticamente enfermos internados na unidade de terapia intensiva do University Hospital of Wales, Cardiff, nos quais a ventilação mecânica foi iniciada.

Recrutamento: Todos os pacientes que satisfaçam os critérios de inclusão e exclusão, internados na UTI de adultos do University Hospital of Wales a partir da data de início do estudo serão considerados elegíveis para recrutamento. Os pacientes identificados pelo consultor de plantão serão notificados à equipe de pesquisa. O consentimento será obtido e, no total, 50 pacientes serão recrutados.

Intervenções: Este é um estudo de boca dividida em que a intervenção (limpeza com um cotonete ou escova de dentes) é realizada em um lado da boca. Por exemplo, cotonete de espuma no lado esquerdo da boca e escova de dentes no lado direito da boca. A limpeza será realizada diariamente por no mínimo 24 horas ou até a extubação ou até sete dias após o recrutamento, o que for menor.

Lavagens broncoalveolares não direcionadas (NBLs) serão realizadas às segundas e quintas-feiras e quando clinicamente indicado (por exemplo, uma suspeita de PAV). Isso envolve a inserção de um cateter de sucção estéril no pulmão, 10-20ml de solução salina estéril são instilados e retirados e colocados em um universal estéril. A amostra será dividida em duas quando houver suspeita de infecção, metade indo para o laboratório de microbiologia do UHW como de costume, a outra metade será analisada como parte do estudo. Se não houver suspeita de infecção, toda a amostra será analisada como parte do estudo.

Métodos: Após o recrutamento, os pacientes terão seus dentes limpos duas vezes ao dia com água estéril por 2 minutos usando uma 'escova de dentes para bebês' e um cotonete de espuma, o lado para o qual o método de limpeza é alocado será randomizado. Um minuto de limpeza atribuído a cada lado da boca.

Um escore modificado de placa de Silness e Loe (Scannapieco et al 1992) e índice gengival (Loe e Silness 1963) serão registrados antes da limpeza e todas as manhãs após a limpeza durante todo o estudo. O índice de placa será registrado nos primeiros molares superiores e inferiores, primeiros pré-molares e incisivos centrais de cada lado da boca a partir da superfície vestibular. A pontuação do índice de placa será uma média dos seis dentes de cada lado. Para pacientes com dentes indicadores ausentes, os dentes remanescentes mais próximos serão pontuados. O índice gengival será pontuado nos mesmos dentes.

Após o registro da placa e do índice gengival, as amostras de placa serão coletadas nos mesmos dentes usados ​​para a pontuação da placa. Amostras de placa supragengival serão então coletadas da terceira porção gengival dos dentes-alvo usando uma cureta estéril antes do início da higiene bucal e, em seguida, uma vez por dia antes da limpeza. A placa será imediatamente inoculada em 1ml de meio de transporte microbiológico. O meio de transporte será diluído em série decimal em solução salina tamponada com fosfato antes da inoculação das placas de ágar usando um sistema de plaqueamento em espiral (Don Whitley Scientific). Para o cultivo dos microrganismos serão utilizados os seguintes ágares: Ágar Sangue (bactérias aeróbicas), Ágar Anaeróbio Fastidioso (bactérias anaeróbias) e CHROMagar Candida (Candida e espécies de leveduras). Contagens diferenciais de bactérias entéricas fermentadoras de lactose serão feitas através do uso de MacConkey Agar, enquanto espécies de Staphylococcus (coagulase positiva e coagulase negativa) serão detectadas usando Manitol Salt Agar (MSA). Os meios inoculados serão incubados em ambientes gasosos apropriados a 37°C por 48 h (aeróbios) ou 7 d (anaeróbicos). Uma contagem microbiana aeróbia total de cada lado será obtida a partir dos ágares de sangue e expressa como unidades formadoras de colônias totais (CFUs).

A identificação de cada morfotipo distinto de colônia será feita por meio de extensa investigação fenotípica. Os testes envolverão coloração de Gram, atividade de oxidase e catalase e perfil bioquímico por meio de uma variedade de sistemas de teste. Os sistemas de testes bioquímicos incluirão o sistema APICoryne (bacilos Gram-positivos), sistema APIStrep (cocos Gram-positivos catalase-negativos), APIStaph e ID32Staph (cocos Gram-positivos catalase-positivos). Os bacilos Gram-negativos oxidase-negativos serão perfilados usando o teste API20E, enquanto os bacilos Gram-negativos oxidase-positivos serão perfilados usando o API NE. Organismos fúngicos (espécies de Candida e leveduras) serão identificados com base na coloração e aparência das colônias em meio diferencial, CHROMagar e por perfis bioquímicos com o sistema Auxocolour 2 (biorad).

NBLs coletados conforme descrito na seção sobre intervenções acima. A identificação dos organismos presentes nas amostras NBL será feita usando os métodos culturais descritos acima.

Se os pacientes forem extubados durante o estudo, o tubo endotraqueal será coletado e transferido para o laboratório. O processamento do ETT envolverá a divisão de cada tubo em seções para identificação quantitativa de organismos por cultura microbiana, análise molecular ou imagem microscópica.

As seções de cada ETT serão inicialmente colocadas em 2 ml de solução salina tamponada com fosfato e misturadas no vórtice por 30 s com esferas de vidro esterilizadas para interromper os agregados do biofilme. A solução de PBS será então removida e diluída em série decimal, 106 vezes.

A identificação dos organismos presentes nos biofilmes será feita usando os métodos culturais descritos acima, juntamente com a análise molecular suplementar (descritas abaixo).

Contaminação bacteriana definida pelo gene do RNA ribossômico 16S de tubos endotraqueais Seções de cada região de tubos endotraqueais recuperados serão analisadas usando procedimentos moleculares. O método envolverá a extração de DNA total de 500 µl das amostras usando um kit de isolamento de DNA bacteriano Puregeneâ (Gentra Systems). Pares de primers bacterianos universais, d88 e e94 (Paster et al, 2001) e primers específicos para organismos-alvo (Porphyromonas gingivalis, Streptococcus mutans, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus) serão então usados ​​para amplificar os alvos do gene 16S rRNA dentro das amostras extraídas usando PCR padrão e condições de reação. Os controles negativos incluirão um controle de reagente (água estéril como modelo de PCR) e um controle de preparação de amostra (água estéril usada no lugar da amostra original e exposta a todo o protocolo de extração). Também serão incluídos controles positivos de DNA molde de espécies conhecidas de P. gingivalis, S. aureus e mutans.

Microscopia confocal de varredura a laser Seções do ETT usado também serão analisadas usando hibridização fluorescente in situ usando sondas de ácido nucléico (PNA) específicas do organismo. Cada sonda específica será conjugada com um rótulo fluorescente distinto para permitir a localização espacial e distribuição de organismos-alvo (S. aureus, P. aeruginosa, Candida albicans, S. mutans) dentro do biofilme ETT.

Coleta de outros dados: Dados demográficos basais dos pacientes serão registrados, incluindo idade, sexo, escore APACHE II, comorbidades, dias a partir da internação hospitalar e administração recente de antibióticos.

Uma pontuação de Zsigmondy e DMFT (dentes cariados, perdidos e obturados) será registrada por um higienista dental durante o estudo para avaliar o estado dentário inicial dos pacientes inscritos.

Medidas de resultado: Resultado primário: placa diária e pontuações gengivais após limpeza mecânica, com identificação e quantificação de bactérias dentro da placa. As comparações quantitativas serão verificadas a partir das contagens totais de CFU transformadas em log e das pontuações de placa e gengiva dos dois métodos de limpeza.