多电极聚集法和氯吡格雷耐药性

本研究的目的是评估一种新的 POC 设备，即多电极聚集仪（Multiplate，Dynabyte，德国慕尼黑）检测氯吡格雷耐药性并预测 2 型糖尿病 (T2DM) 和冠心病患者临床结果的能力动脉疾病 (CAD) 与透光率聚集法 (LTA) 的比较，后者被认为是血小板功能检测的金标准 [7]。 280 名年龄在 20 至 75 岁之间的 T2DM 患者接受了至少 1 个月的口服和/或肠胃外降糖治疗，并且根据既往 ST 抬高、非 ST 抬高急性冠状动脉综合征或不稳定心绞痛的血管造影确定冠状动脉疾病在 CAD 记录后接受氯吡格雷 75 mg/天联合每日口服阿司匹林治疗至少 7 天，将被招募。 患者登记将在希腊雅典“Attiko”大学医院的第二大学心脏病学系进行。 基线评估将包括人口统计数据、病史、心血管危险因素、血液学参数、患病血管数量、支架血管数量、既往心肌梗塞 (MI)、既往血运重建、射血分数和合并用药的记录。 肾功能不全（肌酐水平 > 2.5 mg/dl）或肝功能不全（胆红素水平 > 2 mg/dL）、恶性疾病、使用已知会影响血小板功能的药物、有出血倾向史、血小板计数 < 100x109/L 和血细胞比容 < 28% 将被排除在外。 该方案将由“Attiko”大学医院的机构审查委员会批准，所有患者在接受任何研究程序或接受任何研究治疗之前都将提供书面知情同意书。

血小板功能测量将在研究登记时进行。 患者将被鉴定为对氯吡格雷反应差或反应良好。 主要终点将被定义为心血管原因死亡、非致死性心肌梗死、支架内血栓形成、缺血性中风、急性冠脉综合征紧急再住院和/或 1 年随访期间血运重建的复合终点。 根据 PLATO 标准的大出血事件将在随访期间记录 [8]。

将评估这两种方法检测氯吡格雷抵抗的能力，并将评估抗血小板治疗反应与临床结果之间的潜在相关性。 同时，具有相似特征但接受普拉格雷或替格瑞洛治疗的患者将用作具有相同样本量的对照组。

血小板功能分析 血小板功能分析将在“Attiko”大学医院的血液学实验室和血库单位进行。 在接受抗血小板治疗后 2 至 4 小时，将从肘前静脉收集血样。 将丢弃前 2 至 4 毫升的血液以避免自发的血小板活化，并将在取样后两小时内进行血小板功能测试。

透光聚集法(LTA) 将全血标本收集在3.8%柠檬酸三钠中并以200g离心10分钟以获得富含血小板的血浆(PRP)。 将剩余的标本以 2000 g 再次离心 15 分钟以获得贫血小板血浆 (PPP)。 使用 PPP 可将血小板计数调整至 200,000/μl 和 300,000/μl 之间。 将使用 Biodata-PAP-4 聚集仪（Bio/Data Corporation，PA，USA）进行聚集。 在添加激动剂之前，将使用 PPP 设置 100% 线，并使用 PRP 建立 0% 基线。 使用的激动剂将是 ADP 2.0×10-5 M（Bio/Data Corporation，PA，USA）。 测试程序将如前所述 [9] 进行。 简而言之，将 0.45 mL PRP 转移到比色皿中，在 37 °C 下孵育 3 分钟。 然后将 0.05 mL 的激动剂添加到 PRP 中，并允许生成聚集模式 6 分钟。 使用 PPP 作为参考，将血小板聚集确定为透光率相对于基线的最大百分比变化。 20 microM ADP 刺激后 > 59% 聚集的截止值将被定义为指示高治疗血小板反应性 [10]。 其他测试参数将是后期聚集和解聚程度。

多电极聚集测定法 (MEA) 全血中的血小板聚集将通过 MEA 使用阻抗聚集计（Multiplate，Dynabyte，Munich，Germany）进行评估。 样本将被收集到 3.2% 柠檬酸盐试管中，并根据制造商的说明在采血后半到两小时内进行分析。 终浓度为 6.5 μM 的 ADP 会诱导血小板聚集。 每个一次性测试池包含两对电极，因此可以同时进行两次测量。 聚集将报告为曲线下面积 (AUC)，这是聚集速度和最大聚集的综合量度。 MEA 的 HRPR 截止值（> 468 任意聚合单位/分钟，通过多板分析仪响应 ADP）是根据最近发表的关于治疗中血小板对二磷酸腺苷的高反应性定义的共识声明 [11]。

统计方法

1. 主要终点：

   在这项前瞻性队列研究中，主要终点将定义为 1 年随访期间心血管原因死亡、非致死性心肌梗死、支架内血栓形成、缺血性卒中、急性冠脉综合征紧急再住院和/或血运重建的复合终点时期。 根据 PLATO 标准的大出血事件将在随访期间记录。

2. 描述性统计：

   它们将以平均值±标准差、中位数和四分位数间距 (IQR) 或适当的百分比形式呈现。

3. 对氯吡格雷反应者和非反应者的基线数据（人口统计学数据、病史、心血管危险因素、血液学参数、病变血管数量、既往心肌梗死、既往血运重建、射血分数和合并用药）的比较：

   首先，我们将使用 Shapiro-Wilk 检验来检查数据分布的正态性。 连续变量将通过双样本学生 t 检验（当发现分布正常时）或通过非参数双样本 Wilcoxon rank-sum (Mann-Whitney) 检验（当发现分布时）进行比较非正常）。 分类变量将使用 Pearson 的卡方检验进行比较。

4. 两种检测氯吡格雷耐药性方法的一致性：

   “多板”和“ADP 诱导的 LTA”之间的协议将由 kappa 统计和各自的 p 值确定。 Kappa 值 < 0.20 表示一致性差，0.21 至 0.40 表示一致性一般，0.41 至 0.60 表示一致性一般，0.61 至 0.80 表示一致性良好，>0.81 表示一致性非常好。

5. 实验室耐药性与临床结果的相关性：

   将使用逻辑回归分析来评估检测氯吡格雷抗性的方法（“多板”和“ADP 诱导的 LTA”）是否与临床结果（终点）相关联。 为了评估这些关联是否独立，某些作为众所周知的风险因素的协变量（即，心血管风险因素、患病血管数量、既往心肌梗死、既往血运重建等）将被纳入多变量逻辑回归模型。 将显示原始和调整后的比值比 (OR) 以及相应的 95% 置信区间 (CI)。

6. 显着性水平：

   对于假设检验，< 0.05 的概率水平将被视为具有统计显着性。 所有统计测试都是双面的。

7. 统计软件：

   Stata 软件将用于所有统计分析（Stata Corp.，College Station，TX，USA）。

8. 样本量计算：

对于研究样本量计算，我们假设与非 DM 患者相比，T2DM 患者氯吡格雷耐药 CR(+) 更为普遍 [12, 13]；同时，DM 组的氯吡格雷抵抗患者发生不良心血管事件的可能性增加 [14]。 研究表明，一般人群中有 13% 的 T2DM 患者患有主要不良心血管事件（MACE）[包括继发于心血管原因的死亡、ST 段抬高型心肌梗死（STEMI）、非 ST 段抬高型心肌梗死（ NSTEMI）和不稳定型心绞痛（UA）和中风]；在氯吡格雷耐药且仍在接受氯吡格雷治疗的 T2DM 患者中，这一数字增加到 38% [15]。 检测 CR(+) 和 CR(-) 糖尿病患者之间不良事件发生率差异所需的样本量，双侧风险为 5%，b 风险为 20%（80% 的功效） 101 例患者 [CR(+) 组 40 例，CR(-) 组 61 例]。 如果我们假设流失率为 10%，则样本量应进一步增加到 111 名患者 [CR(+) 组 44 名，CR(-) 组 67 名]。 最后，考虑到估计 T2DM 患者的氯吡格雷耐药率可达到约 40% [16-18]，所有糖尿病患者的初始样本应大 2.5 倍，即 278 名患者（111 名氯吡格雷耐药和 167 名氯吡格雷-敏感的）。 统计软件G*Power 3.1.3 （德国基尔）用于样本量计算。