Aggregometri med flera elektroder och klopidogrelresistens

Syftet med denna studie är att utvärdera förmågan hos en ny POC-enhet, multipelelektrodaggregometri (Multiplate, Dynabyte, München, Tyskland) för att upptäcka klopidogrelresistens och förutsäga det kliniska resultatet hos patienter med typ 2-diabetes mellitus (T2DM) och kranskärlssjukdom. artärsjukdom (CAD) i jämförelse med ljustransmittansaggregometri (LTA), som anses vara guldstandarden för blodplättsfunktionstestning [7]. 280 patienter med T2DM mellan 20 och 75 år som behandlats med oral och/eller parenteral hypoglykemisk terapi i minst 1 månad och angiografiskt konstaterad kranskärlssjukdom på grund av en tidigare ST-förhöjning, icke-ST-höjning akut kranskärlssyndrom eller instabil angina behandlas med klopidogrel 75 mg/dag i kombination med daglig per os aspirinbehandling i minst 7 dagar efter dokumentation av CAD, kommer att rekryteras. Patientregistrering kommer att äga rum på andra universitetsavdelningen för kardiologi vid "Attiko" universitetssjukhus i Aten, Grekland. Baslinjebedömning kommer att innefatta registrering av demografiska data, medicinsk historia, kardiovaskulära riskfaktorer, hematologiska parametrar, antal sjuka kärl, antal stenterade kärl, tidigare hjärtinfarkt (MI), tidigare revaskularisering, ejektionsfraktion och samtidig medicinering. Patienter med njurinsufficiens (kreatininnivåer > 2,5 mg/dl) eller lever (bilirubinnivå > 2 mg/dL), malign sjukdom, användning av läkemedel som är kända för att påverka trombocytfunktionen, anamnes på blödningsdiates, trombocytantal < 100x109/L och en hematokrit < 28 % kommer att uteslutas. Protokollet kommer att godkännas av den institutionella granskningsnämnden för "Attiko" universitetssjukhus och alla patienter kommer att ge skriftligt informerat samtycke innan de genomgår någon studieprocedur eller får någon studiebehandling.

Trombocytfunktionsmätningar kommer att utföras vid studieregistreringen. Patienter kommer att identifieras antingen som dåliga eller bra svar på klopidogrel. Den primära slutpunkten kommer att definieras som en sammansättning av dödsfall till följd av kardiovaskulära orsaker, icke-fatal hjärtinfarkt, stenttrombos, ischemisk stroke, akut återinläggning för akut koronarsyndrom och/eller revaskularisering under 1-års uppföljningsperiod. Episoder av större blödningar enligt PLATO-kriterier kommer att registreras under uppföljningen [8].

Förmågan hos de två metoderna att upptäcka klopidogrelresistens kommer att utvärderas och den potentiella korrelationen mellan respons på trombocytbehandling och kliniskt utfall kommer att bedömas. Parallellt kommer patienter med liknande egenskaper, men behandlade med prasugrel eller ticagrelor, att användas som kontrollgrupp av samma provstorlek.

Blodplättsfunktionsanalys Blodplättsfunktionsanalys kommer att utföras i laboratoriet för hematologi och blodbanksenheten på "Attiko" universitetssjukhus. Blodprover kommer att samlas in från en antecubital ven 2 till 4 timmar efter intag av antitrombocytbehandling. De första 2 till 4 ml blod kommer att kasseras för att undvika spontan trombocytaktivering och blodplättsfunktionstester kommer att utföras inom två timmar efter provtagningen.

Ljustransmittansaggregometri (LTA) Helblodsprovet tas i 3,8 % trinatriumcitrat och centrifugeras vid 200 g i 10 minuter för att erhålla blodplättsrik plasma (PRP). Det återstående provet kommer att återcentrifugeras vid 2000 g i 15 minuter för att erhålla blodplättsfattig plasma (PPP). Trombocytantalet kommer att justeras till mellan 200 000/μl och 300 000/μl med PPP. Aggregering kommer att utföras med hjälp av en Biodata-PAP-4 aggregometer (Bio/Data Corporation, PA, USA). 100 %-linjen kommer att ställas in med PPP och en 0 %-baslinje upprättas med PRP före tillsats av agonisten. Den använda agonisten kommer att vara ADP 2,0×10-5 M (Bio/Data Corporation, PA, USA). Testproceduren kommer att utföras som tidigare beskrivits [9]. I korthet överförs 0,45 ml PRP till en kyvett som inkuberats vid 37 °C i 3 minuter. Sedan tillsätts 0,05 ml av agonisten till PRP och aggregeringsmönstret tillåts generera under 6 minuter. Trombocytaggregation bestämdes som den maximala procentuella förändringen i ljustransmittans från baslinjen med användning av PPP som referens. Gränsvärde på > 59 % aggregation efter 20 mikroM ADP-stimulering kommer att definieras som det som indikerar hög trombocytreaktivitet under behandling [10]. Andra testade parametrar kommer att vara sen aggregering och graden av disaggregering.

Multipelelektrodaggregometri (MEA) Trombocytaggregation i helblod kommer att bedömas med MEA med hjälp av en impedansaggregometer (Multiplate, Dynabyte, München, Tyskland). Prover kommer att samlas in i 3,2 % citratrör och analyseras inom en halv till två timmar efter blodprovtagning enligt tillverkarens instruktioner. Trombocytaggregation kommer att induceras av ADP i slutkoncentrationen 6,5 μM. Varje engångstestcell innehåller två par elektroder, vilket möjliggör två samtidiga mätningar. Aggregation kommer att rapporteras som area under the curve (AUC), ett integrerat mått på aggregationshastighet och maximal aggregation. Gränsvärde för HRPR med MEA (> 468 godtyckliga aggregationsenheter/min som svar på ADP med Multiplate-analysator) definierades enligt det nyligen publicerade konsensusuttalandet om definitionen av hög trombocytreaktivitet under behandling mot adenosindifosfat [11].

Statistiska metoder

1. Primär slutpunkt:

   I denna prospektiva kohortstudie kommer den primära slutpunkten att definieras som en sammansättning av dödsfall från kardiovaskulära orsaker, icke-fatal hjärtinfarkt, stenttrombos, ischemisk stroke, akut återinläggning för akut kranskärlssyndrom och/eller revaskularisering under 1-årsuppföljningen period. Episoder av större blödningar enligt PLATOs kriterier kommer att registreras under uppföljningen.

2. Beskrivande statistik:

   De kommer att presenteras som medelvärden ± SD, medianer och interkvartilintervall (IQR), eller procentsatser när så är lämpligt.

3. Jämförelse av baslinjedata (demografiska data, medicinsk historia, kardiovaskulära riskfaktorer, hematologiska parametrar, antal sjuka kärl, tidigare hjärtinfarkt, tidigare revaskularisering, ejektionsfraktion och samtidig medicinering) mellan patienter som svarar på klopidogrel och som inte svarar:

   Först kommer vi att använda Shapiro-Wilk-testet för att kontrollera om datadistributionerna är normala. Kontinuerliga variabler kommer att jämföras med hjälp av Students t-test med två urval (när fördelningen befinns vara normal) eller med hjälp av det icke-parametriska Wilcoxon ranksumma-testet med två urval (Mann-Whitney) (när fördelningen hittas icke-normalt). Kategoriska variabler kommer att jämföras med Pearsons chi-kvadrattest.

4. Överensstämmelse mellan de två metoderna för att detektera resistens mot klopidogrel:

   Överensstämmelse mellan "Multiplat" och "ADP-inducerad LTA" kommer att bestämmas av kappa-statistik och respektive p-värden. Kappa-värden på < 0,20 anses indikera dålig överensstämmelse, 0,21 till 0,40 indikerar rättvis överensstämmelse, 0,41 till 0,60 indikerar måttlig överensstämmelse, 0,61 till 0,80 indikerar bra överensstämmelse och >0,81 indikerar mycket god överensstämmelse.

5. Korrelation av laboratorieresistens med kliniskt resultat:

   Logistisk regressionsanalys kommer att användas för att utvärdera om metoderna för att påvisa resistens mot klopidogrel ("Multiplate" och "ADP-induced LTA") är associerade med det kliniska resultatet (end-point). För att utvärdera om dessa samband är oberoende, kommer vissa kovariater som är välkända riskfaktorer (dvs kardiovaskulära riskfaktorer, antal sjuka kärl, tidigare hjärtinfarkt, tidigare revaskularisering, etc) att inkluderas i de multivariabla logistiska regressionsmodellerna. De råa och de justerade oddskvoterna (OR) och motsvarande 95 % konfidensintervall (CI) kommer att presenteras.

6. Nivå av betydelse:

   För hypotesprövning kommer en sannolikhetsnivå på < 0,05 att betraktas som statistiskt signifikant. Alla statistiska tester kommer att vara dubbelsidiga.

7. Statistisk programvara:

   Stata programvara kommer att användas för alla statistiska analyser (Stata Corp., College Station, TX, USA).

8. Provstorleksberäkning:

För beräkningen av studiens provstorlek antar vi att klopidogrelresistens CR(+) är vanligare bland T2DM-patienter jämfört med icke-DM-patienter [12, 13]; samtidigt lider DM-gruppen av patienter med klopidogrelresistens en ökad sannolikhet för kardiovaskulära biverkningar [14]. Det har visat sig att 13 % av den allmänna populationen av T2DM-patienter lider av en allvarlig kardiovaskulär händelse (MACE) [inklusive död sekundär till kardiovaskulär orsak, ST-hjärtinfarkt (STEMI), hjärtinfarkt utan ST-stegshöjning ( NSTEMI) och instabil angina (UA) och stroke]; detta antal ökar till 38 % bland T2DM-patienter med klopidogrelresistens som förblir på klopidogrelbehandling [15]. Den urvalsstorlek som behövs för att upptäcka denna skillnad i biverkningsfrekvens - mellan CR(+) och CR(-) diabetespatienter - med en dubbelsidig risk på 5 % och en b-risk på 20 % (styrka på 80 %) kommer att ha till 101 patienter [40 i CR(+)-gruppen och 61 i CR(-)-gruppen]. Om vi ​​antar en förslitningsgrad på 10 % bör urvalsstorleken ökas ytterligare till 111 patienter [44 i CR(+)-gruppen och 67 i CR(-)-gruppen]. Slutligen, med beaktande av att klopidogrelresistens bland T2DM-patienter kan uppskattas till cirka 40 % [16-18], bör det initiala urvalet av alla diabetespatienter vara 2,5 gånger större, eller 278 patienter (111 klopidogrelresistenta och 167 klopidogrel-resistenta känslig). Den statistiska programvaran G*Power 3.1.3 (Kiel, Tyskland) användes för beräkning av provstorlek.