Agregometria de Múltiplos Eletrodos e Resistência ao Clopidogrel

O objetivo deste estudo é avaliar a capacidade de um novo dispositivo POC, a agregometria de múltiplos eletrodos (Multiplate, Dynabyte, Munique, Alemanha) para detectar resistência ao clopidogrel e prever o resultado clínico em pacientes com diabetes mellitus tipo 2 (T2DM) e doença coronariana doença arterial coronariana (DAC) em comparação com a agregometria por transmitância de luz (LTA), que é considerada o padrão-ouro dos testes de função plaquetária [7]. 280 pacientes com DM2 entre 20 e 75 anos de idade tratados com terapia hipoglicemiante oral e/ou parenteral por pelo menos 1 mês e doença arterial coronariana angiograficamente estabelecida com base em elevação prévia do segmento ST, síndrome coronariana aguda sem elevação do segmento ST ou angina instável tratados com clopidogrel 75 mg/dia em combinação com terapia diária com aspirina por via oral por pelo menos 7 dias após documentação de DAC, serão recrutados. A inscrição dos pacientes ocorrerá no Departamento de Cardiologia da Segunda Universidade do Hospital Universitário "Attiko" em Atenas, Grécia. A avaliação inicial incluirá o registro de dados demográficos, histórico médico, fatores de risco cardiovascular, parâmetros hematológicos, número de vasos doentes, número de vasos com stent, infarto do miocárdio (IM) anterior, revascularização anterior, fração de ejeção e medicamentos concomitantes. Pacientes com insuficiência renal (níveis de creatinina > 2,5 mg/dl) ou hepática (nível de bilirrubina > 2 mg/dL), doença maligna, uso de medicamentos conhecidos por afetar a função plaquetária, história de diátese hemorrágica, contagem de plaquetas < 100x109/L e hematócrito < 28% será excluído. O protocolo será aprovado pelo conselho de revisão institucional do "Attiko" University Hospital e todos os pacientes darão consentimento informado por escrito antes de passar por qualquer procedimento do estudo ou receber qualquer tratamento do estudo.

As medições da função plaquetária serão realizadas na inscrição no estudo. Os pacientes serão identificados como respondedores ruins ou bons ao clopidogrel. O desfecho primário será definido como um composto de morte por causas cardiovasculares, infarto do miocárdio não fatal, trombose de stent, acidente vascular cerebral isquêmico, re-hospitalização urgente por síndrome coronariana aguda e/ou revascularização durante o período de acompanhamento de 1 ano. Episódios de sangramento maior de acordo com os critérios PLATO serão registrados durante o acompanhamento [8].

A capacidade dos dois métodos para detectar a resistência ao clopidogrel será avaliada e a correlação potencial entre a resposta ao tratamento antiplaquetário e o resultado clínico será avaliada. Paralelamente, pacientes com características semelhantes, mas tratados com prasugrel ou ticagrelor, serão usados ​​como grupo controle de mesmo tamanho amostral.

Análise da função plaquetária A análise da função plaquetária será realizada no Laboratório de Hematologia e Unidade de Banco de Sangue do Hospital Universitário "Attiko". Amostras de sangue serão coletadas de uma veia antecubital 2 a 4 h após a ingestão da terapia antiplaquetária. Os primeiros 2 a 4 ml de sangue serão descartados para evitar a ativação plaquetária espontânea e testes de função plaquetária serão realizados dentro de duas horas após a coleta.

Agregometria por transmitância luminosa (LTA) A amostra de sangue total será coletada em citrato trissódico 3,8% e centrifugada a 200 g por 10 minutos para obtenção de plasma rico em plaquetas (PRP). A amostra restante será centrifugada novamente a 2.000 g por 15 minutos para obter plasma pobre em plaquetas (PPP). A contagem de plaquetas será ajustada entre 200.000/μl e 300.000/μl com PPP. A agregação será realizada usando um agregômetro Biodata-PAP-4 (Bio/Data Corporation, PA, EUA). A linha de 100% será definida usando PPP e uma linha de base de 0% estabelecida com PRP antes da adição do agonista. O agonista utilizado será o ADP 2,0×10-5 M (Bio/Data Corporation, PA, EUA). O procedimento de teste será realizado conforme descrito anteriormente [9]. Resumidamente, 0,45 mL de PRP é transferido para uma cubeta incubada a 37 °C por 3 minutos. Em seguida, 0,05 mL do agonista é adicionado ao PRP e o padrão de agregação é gerado por 6 minutos. A agregação de plaquetas foi determinada como a variação percentual máxima na transmitância de luz desde a linha de base usando PPP como referência. O valor de corte de > 59% de agregação após estimulação de ADP de 20 microM será definido como aquele que indica alta reatividade plaquetária durante o tratamento [10]. Outros parâmetros testados serão a agregação tardia e o grau de desagregação.

Agregometria de múltiplos eletrodos (MEA) A agregação plaquetária em sangue total será avaliada por MEA usando um agregômetro de impedância (Multiplate, Dynabyte, Munique, Alemanha). As amostras serão coletadas em tubos de citrato 3,2% e analisadas no período de meia a duas horas após a coleta de sangue conforme instruções do fabricante. A agregação plaquetária será induzida por ADP na concentração final de 6,5 μM. Cada célula de teste descartável contém dois pares de eletrodos, permitindo assim duas medições simultâneas. A agregação será relatada como área sob a curva (AUC), uma medida integrada da velocidade de agregação e agregação máxima. O valor de corte para HRPR por MEA (> 468 unidades de agregação arbitrárias/min em resposta ao ADP pelo analisador Multiplate) foi definido de acordo com a declaração de consenso publicada recentemente sobre a definição de alta reatividade plaquetária durante o tratamento ao difosfato de adenosina [11].

Métodos estatísticos

1. Ponto final primário:

   Neste estudo de coorte prospectivo, o desfecho primário será definido como um composto de morte por causas cardiovasculares, infarto do miocárdio não fatal, trombose de stent, acidente vascular cerebral isquêmico, reinternação urgente por síndrome coronariana aguda e/ou revascularização durante o acompanhamento de 1 ano período. Episódios de sangramento maior de acordo com os critérios PLATO serão registrados durante o acompanhamento.

2. Estatísticas descritivas:

   Eles serão apresentados como médias ± DP, medianas e intervalos interquartis (IQR) ou percentuais quando apropriado.

3. Comparação de dados basais (dados demográficos, histórico médico, fatores de risco cardiovascular, parâmetros hematológicos, número de vasos doentes, infarto do miocárdio prévio, revascularização prévia, fração de ejeção e medicações concomitantes) entre respondedores e não respondedores ao clopidogrel:

   Primeiro, usaremos o teste de Shapiro-Wilk para verificar a normalidade das distribuições de dados. As variáveis ​​contínuas serão comparadas por meio do teste t de Student para duas amostras (quando a distribuição for considerada normal) ou por meio do teste não paramétrico Wilcoxon rank-sum (Mann-Whitney) de duas amostras para duas amostras (quando a distribuição for encontrada não normal). As variáveis ​​categóricas serão comparadas por meio do teste qui-quadrado de Pearson.

4. Concordância dos dois métodos na detecção de resistência ao clopidogrel:

   A concordância entre "Multiplaca" e "LTA induzida por ADP" será determinada pela estatística kappa e os respectivos p-valores. Valores de Kappa < 0,20 são considerados para concordância ruim, 0,21 a 0,40 indicam concordância regular, 0,41 a 0,60 indicam concordância moderada, 0,61 a 0,80 indicam concordância boa e > 0,81 indicam concordância muito boa.

5. Correlação da resistência laboratorial com o resultado clínico:

   A análise de regressão logística será utilizada para avaliar se os métodos de detecção de resistência ao clopidogrel ("Multiplaca" e "LTA induzida por ADP") estão associados ao desfecho clínico (end-point). Para avaliar se essas associações são independentes, certas covariáveis ​​que são fatores de risco bem conhecidos (ou seja, fatores de risco cardiovascular, número de vasos doentes, infarto do miocárdio prévio, revascularização prévia, etc.) serão incluídas nos modelos de regressão logística multivariada. Serão apresentados os odds ratio (ORs) brutos e ajustados e os intervalos de confiança (ICs) de 95% correspondentes.

6. Nível de significância:

   Para o teste de hipótese, um nível de probabilidade < 0,05 será considerado estatisticamente significativo. Todos os testes estatísticos serão bilaterais.

7. Software estatístico:

   O software Stata será usado para todas as análises estatísticas (Stata Corp., College Station, TX, EUA).

8. Cálculo do tamanho da amostra:

Para o cálculo do tamanho da amostra do estudo, levantamos a hipótese de que a resistência ao clopidogrel CR(+) é mais prevalente entre pacientes com DM2 em comparação com pacientes sem DM [12, 13]; ao mesmo tempo, o grupo DM de pacientes com resistência ao clopidogrel sofre uma probabilidade aumentada de eventos cardiovasculares adversos [14]. Foi demonstrado que 13% da população geral de pacientes com DM2 sofrem um evento cardiovascular adverso maior (MACE) [incluindo morte secundária a causa cardiovascular, infarto do miocárdio com elevação do segmento ST (STEMI), infarto do miocárdio sem elevação do segmento ST ( NSTEMI) e angina instável (AI) e acidente vascular cerebral]; esse número aumenta para 38% entre os pacientes com DM2 com resistência ao clopidogrel que permanecem em tratamento com clopidogrel [15]. O tamanho da amostra necessário para detectar essa diferença nas taxas de eventos adversos - entre pacientes diabéticos CR(+) e CR(-) - com risco bilateral de 5% e risco b de 20% (poder de 80%) terá ser 101 pacientes [40 no grupo CR(+) e 61 no grupo CR(-)]. Se assumirmos uma taxa de atrito de 10%, o tamanho da amostra deve ser aumentado para 111 pacientes [44 no grupo CR(+) e 67 no grupo CR(-)]. Finalmente, considerando que a resistência ao clopidogrel entre os pacientes com DM2 pode ser estimada em aproximadamente 40% [16-18], a amostra inicial de todos os pacientes diabéticos deve ser 2,5 vezes maior, ou 278 pacientes (111 resistentes ao clopidogrel e 167 resistentes ao clopidogrel confidencial). O software estatístico G*Power 3.1.3 (Kiel, Alemanha) foi usado para cálculo do tamanho da amostra.