Многоэлектродная агрегометрия и устойчивость к клопидогрелю

Целью данного исследования является оценка способности нового POC-устройства, мультиэлектродной агрегометрии (Multiplate, Dynabyte, Мюнхен, Германия) выявлять резистентность к клопидогрелу и прогнозировать клинический исход у пациентов с сахарным диабетом 2 типа (СД2) и коронарной недостаточностью. заболевания артерий (ИБС) по сравнению с агрегометрией светопропускания (ЛТА), которая считается золотым стандартом исследования функции тромбоцитов [7]. 280 пациентов с СД2 в возрасте от 20 до 75 лет, получавших пероральную и/или парентеральную сахароснижающую терапию в течение не менее 1 месяца, и ангиографически установленное заболевание коронарных артерий на основании предшествующего подъема сегмента ST, острого коронарного синдрома без подъема сегмента ST или нестабильной стенокардии лечение клопидогрелем в дозе 75 мг/сут в сочетании с ежедневной пероральной терапией аспирином в течение не менее 7 дней после документирования ИБС. Набор пациентов будет проходить во втором отделении кардиологии университетской больницы «Аттико» в Афинах, Греция. Исходная оценка будет включать запись демографических данных, истории болезни, сердечно-сосудистых факторов риска, гематологических параметров, количества пораженных сосудов, количества стентированных сосудов, предшествующего инфаркта миокарда (ИМ), предшествующей реваскуляризации, фракции выброса и сопутствующих лекарств. Пациенты с почечной (уровень креатинина > 2,5 мг/дл) или печеночной (уровень билирубина > 2 мг/дл) недостаточностью, злокачественными заболеваниями, приемом препаратов, влияющих на функцию тромбоцитов, геморрагическим диатезом в анамнезе, количеством тромбоцитов < 100x109/л и гематокрит < 28% будет исключен. Протокол будет одобрен институциональным наблюдательным советом университетской больницы «Аттико», и все пациенты дадут письменное информированное согласие перед прохождением какой-либо процедуры исследования или получением любого исследуемого лечения.

Измерения функции тромбоцитов будут выполняться при включении в исследование. Пациенты будут идентифицированы как плохо или хорошо реагирующие на клопидогрел. Первичная конечная точка будет определяться как комбинация смерти от сердечно-сосудистых причин, нефатального инфаркта миокарда, тромбоза стента, ишемического инсульта, срочной повторной госпитализации по поводу острого коронарного синдрома и/или реваскуляризации в течение 1 года наблюдения. Эпизоды больших кровотечений по критериям PLATO будут фиксироваться при динамическом наблюдении [8].

Будет оцениваться способность этих двух методов выявлять резистентность к клопидогрелу, а также потенциальная корреляция между ответом на антитромбоцитарную терапию и клиническим исходом. Параллельно пациенты со схожими характеристиками, но получавшие прасугрел или тикагрелор, будут использоваться в качестве контрольной группы того же размера выборки.

Анализ функции тромбоцитов Анализ функции тромбоцитов будет проводиться в лаборатории гематологии и банка крови университетской больницы «Аттико». Образцы крови будут собираться из локтевой вены через 2-4 часа после приема антитромбоцитарной терапии. Первые 2–4 мл крови будут выброшены, чтобы избежать спонтанной активации тромбоцитов, и в течение двух часов после взятия пробы будут проведены тесты функции тромбоцитов.

Агрегометрия светопропускания (LTA) Образец цельной крови собирают в 3,8% растворе цитрата натрия и центрифугируют при 200 g в течение 10 минут для получения обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP). Оставшийся образец будет повторно центрифугирован при 2000 g в течение 15 минут для получения бедной тромбоцитами плазмы (PPP). Количество тромбоцитов будет доведено до значений от 200 000/мкл до 300 000/мкл с помощью PPP. Агрегацию будут проводить с использованием агрегометра Biodata-PAP-4 (Bio/Data Corporation, PA, USA). Линия 100% будет установлена ​​с использованием PPP, а исходный уровень 0% будет установлен с помощью PRP перед добавлением агониста. Используемым агонистом будет ADP 2,0×10-5 M (Bio/Data Corporation, PA, USA). Процедура испытаний будет выполняться, как описано ранее [9]. Вкратце, 0,45 мл PRP переносят в кювету и инкубируют при 37 °C в течение 3 минут. Затем в PRP добавляют 0,05 мл агониста и дают модели агрегации сформироваться в течение 6 минут. Агрегацию тромбоцитов определяли как максимальное процентное изменение коэффициента пропускания света по сравнению с исходным уровнем с использованием PPP в качестве эталона. Пороговое значение > 59% агрегации после стимуляции 20 мкМ АДФ будет определяться как значение, указывающее на высокую реактивность тромбоцитов при лечении [10]. Другими тестируемыми параметрами будут поздняя агрегация и степень дезагрегации.

Многоэлектродная агрегометрия (МЭА) Агрегацию тромбоцитов в цельной крови оценивают с помощью МЭА с использованием импедансного агрегометра (Multiplate, Dynabyte, Мюнхен, Германия). Образцы будут собираться в пробирки с 3,2% цитрата и анализироваться в течение периода от получаса до двух часов после сбора крови в соответствии с инструкциями производителя. Агрегацию тромбоцитов индуцирует АДФ в конечной концентрации 6,5 мкМ. Каждая одноразовая тестовая ячейка содержит две пары электродов, что позволяет проводить два одновременных измерения. Агрегация будет представлена ​​как площадь под кривой (AUC), интегрированная мера скорости агрегации и максимальной агрегации. Пороговое значение для HRPR с помощью MEA (> 468 условных единиц агрегации/мин в ответ на ADP с помощью анализатора Multiplate) было определено в соответствии с недавно опубликованным консенсусным заявлением об определении высокой реактивности тромбоцитов при лечении к аденозиндифосфату [11].

Статистические методы

1. Первичная конечная точка:

   В этом проспективном когортном исследовании первичная конечная точка будет определена как комбинация смерти от сердечно-сосудистых причин, нефатального инфаркта миокарда, тромбоза стента, ишемического инсульта, срочной повторной госпитализации по поводу острого коронарного синдрома и/или реваскуляризации в течение 1 года наблюдения. период. Эпизоды больших кровотечений по критериям PLATO будут регистрироваться во время наблюдения.

2. Описательная статистика:

   Они будут представлены как среднее ± стандартное отклонение, медианы и межквартильные размахи (IQR) или проценты, когда это уместно.

3. Сравнение исходных данных (демографические данные, анамнез, факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний, гематологические параметры, количество пораженных сосудов, перенесенный инфаркт миокарда, предыдущая реваскуляризация, фракция выброса и сопутствующие препараты) между ответившими и не ответившими на терапию клопидогрелом:

   Во-первых, мы будем использовать тест Шапиро-Уилка для проверки нормальности распределения данных. Непрерывные переменные будут сравниваться с помощью двухвыборочного критерия Стьюдента (когда распределение окажется нормальным) или с помощью непараметрического двухвыборочного критерия суммы рангов Уилкоксона (Манна-Уитни) (когда распределение будет найдено). ненормальный). Категориальные переменные будут сравниваться с использованием критерия хи-квадрат Пирсона.

4. Согласованность двух методов определения устойчивости к клопидогрелу:

   Согласие между «Multiplate» и «ADP-индуцированным LTA» будет определяться статистикой каппа и соответствующими p-значениями. Считается, что значения каппа <0,20 указывают на плохое согласие, от 0,21 до 0,40 — на удовлетворительное согласие, от 0,41 до 0,60 — на умеренное согласие, от 0,61 до 0,80 — на хорошее согласие и >0,81 — на очень хорошее согласие.

5. Корреляция лабораторной резистентности с клиническим исходом:

   Логистический регрессионный анализ будет использоваться для того, чтобы оценить, связаны ли методы выявления устойчивости к клопидогрелю («Многопланшетный» и «АДФ-индуцированный LTA») с клиническим исходом (конечной точкой). Чтобы оценить, являются ли эти ассоциации независимыми, в многовариантные модели логистической регрессии будут включены определенные ковариаты, которые являются хорошо известными факторами риска (например, сердечно-сосудистые факторы риска, количество пораженных сосудов, предшествующий инфаркт миокарда, предыдущая реваскуляризация и т. д.). Будут представлены грубые и скорректированные отношения шансов (ОШ) и соответствующие 95% доверительные интервалы (ДИ).

6. Уровень значимости:

   Для проверки гипотез уровень вероятности <0,05 будет считаться статистически значимым. Все статистические тесты будут двусторонними.

7. Статистическое программное обеспечение:

   Программное обеспечение Stata будет использоваться для всех статистических анализов (Stata Corp., College Station, TX, USA).

8. Расчет размера выборки:

Для расчета размера выборки исследования мы предполагаем, что CR(+) резистентности к клопидогрелу более распространен среди пациентов с СД2 по сравнению с пациентами без СД [12, 13]; в то же время в группе больных СД с резистентностью к клопидогрелу повышена вероятность неблагоприятных сердечно-сосудистых событий [14]. Было показано, что 13% общей популяции пациентов с СД2 страдают серьезными неблагоприятными сердечно-сосудистыми событиями (MACE) [включая смерть, вторичную по сердечно-сосудистым причинам, инфаркт миокарда с подъемом сегмента ST (STEMI), инфаркт миокарда без подъема сегмента ST. NSTEMI) и нестабильной стенокардии (НС) и инсульта]; это число увеличивается до 38% среди пациентов с СД2 с резистентностью к клопидогрелу, которые продолжают лечение клопидогрелом [15]. Размер выборки, необходимый для выявления этой разницы в частоте неблагоприятных событий — между CR (+) и CR (-) пациентов с диабетом — с двусторонним риском a 5% и риском b 20% (мощность 80%) будет иметь составил 101 пациент [40 в группе ПР(+) и 61 в группе ПР(-)]. Если предположить, что уровень отсева составляет 10%, размер выборки следует увеличить до 111 пациентов [44 в группе CR(+) и 67 в группе CR(-)]. Наконец, принимая во внимание, что резистентность к клопидогрелу среди пациентов с СД2 может достигать примерно 40% [16-18], исходная выборка всех пациентов с диабетом должна быть в 2,5 раза больше, или 278 пациентов (111 клопидогрелерезистентных и 167 клопидогреле- чувствительный). Статистическое программное обеспечение G*Power 3.1.3 (Киль, Германия) использовали для расчета размера выборки.