Mehrelektroden-Aggregometrie und Clopidogrel-Resistenz

Ziel dieser Studie ist es, die Fähigkeit eines neuen POC-Geräts, der Mehrfachelektroden-Aggregometrie (Multiplate, Dynabyte, München, Deutschland), zu bewerten, Clopidogrel-Resistenz zu erkennen und das klinische Ergebnis bei Patienten mit Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) und Koronarerkrankungen vorherzusagen Arterienerkrankung (KHK) im Vergleich zur Lichttransmissionsaggregometrie (LTA), die als Goldstandard für Thrombozytenfunktionstests gilt [7]. 280 Patienten mit T2DM im Alter zwischen 20 und 75 Jahren, die mindestens einen Monat lang mit oraler und/oder parenteraler hypoglykämischer Therapie behandelt wurden und angiographisch festgestellte koronare Herzkrankheit aufgrund einer früheren ST-Hebung, eines akuten Koronarsyndroms ohne ST-Hebung oder einer instabilen Angina pectoris hatten Rekrutiert werden Patienten, die mit Clopidogrel 75 mg/Tag in Kombination mit einer täglichen per-os-Aspirin-Therapie für mindestens 7 Tage nach Dokumentation der CAD behandelt werden. Die Aufnahme der Patienten erfolgt in der zweiten Universitätsabteilung für Kardiologie des Universitätskrankenhauses „Attiko“ in Athen, Griechenland. Die Basisbewertung umfasst die Erfassung demografischer Daten, der Krankengeschichte, kardiovaskulärer Risikofaktoren, hämatologischer Parameter, Anzahl der erkrankten Gefäße, Anzahl der mit Stents versehenen Gefäße, früherer Myokardinfarkt (MI), früherer Revaskularisierung, Ejektionsfraktion und Begleitmedikation. Patienten mit Nieren- (Kreatininspiegel > 2,5 mg/dl) oder Leberinsuffizienz (Bilirubinspiegel > 2 mg/dl), bösartiger Erkrankung, Einnahme von Medikamenten, von denen bekannt ist, dass sie die Thrombozytenfunktion beeinflussen, Blutungsdiathese in der Vorgeschichte, Thrombozytenzahl < 100 x 109/l und a Hämatokrit < 28 % wird ausgeschlossen. Das Protokoll wird vom institutionellen Prüfungsausschuss des Universitätsklinikums „Attiko“ genehmigt und alle Patienten geben eine schriftliche Einverständniserklärung ab, bevor sie sich einem Studienverfahren unterziehen oder eine Studienbehandlung erhalten.

Bei der Studieneinschreibung werden Messungen der Thrombozytenfunktion durchgeführt. Es wird festgestellt, dass die Patienten entweder schlecht oder gut auf Clopidogrel ansprechen. Der primäre Endpunkt wird definiert als eine Kombination aus Tod aus kardiovaskulären Gründen, nichttödlichem Myokardinfarkt, Stentthrombose, ischämischem Schlaganfall, dringender Rehospitalisierung wegen akutem Koronarsyndrom und/oder Revaskularisierung während der einjährigen Nachbeobachtungszeit. Episoden schwerer Blutungen gemäß PLATO-Kriterien werden während der Nachuntersuchung erfasst [8].

Die Fähigkeit der beiden Methoden zum Nachweis einer Clopidogrel-Resistenz wird evaluiert und die mögliche Korrelation zwischen dem Ansprechen auf eine Thrombozytenaggregationshemmung und dem klinischen Ergebnis beurteilt. Parallel dazu werden Patienten mit ähnlichen Merkmalen, die jedoch mit Prasugrel oder Ticagrelor behandelt werden, als Kontrollgruppe mit derselben Stichprobengröße verwendet.

Thrombozytenfunktionsanalyse Die Thrombozytenfunktionsanalyse wird im Labor für Hämatologie und in der Blutbankabteilung des Universitätsklinikums „Attiko“ durchgeführt. 2 bis 4 Stunden nach Einnahme der Thrombozytenaggregationshemmung werden Blutproben aus einer Vena antecubitalis entnommen. Die ersten 2 bis 4 ml Blut werden verworfen, um eine spontane Aktivierung der Blutplättchen zu vermeiden. Innerhalb von zwei Stunden nach der Blutentnahme werden Blutplättchenfunktionstests durchgeführt.

Lichtdurchlässigkeitsaggregometrie (LTA) Die Vollblutprobe wird in 3,8 % Trinatriumcitrat gesammelt und 10 Minuten lang bei 200 g zentrifugiert, um plättchenreiches Plasma (PRP) zu erhalten. Die verbleibende Probe wird erneut 15 Minuten lang bei 2000 g zentrifugiert, um plättchenarmes Plasma (PPP) zu erhalten. Die Thrombozytenzahl wird mit PPP auf einen Wert zwischen 200.000/μl und 300.000/μl eingestellt. Die Aggregation wird mit einem Biodata-PAP-4-Aggregometer (Bio/Data Corporation, PA, USA) durchgeführt. Vor der Zugabe des Agonisten wird mit PPP die 100 %-Linie und mit PRP eine 0 %-Basislinie festgelegt. Als Agonist wird ADP 2,0×10-5 M (Bio/Data Corporation, PA, USA) verwendet. Das Testverfahren wird wie zuvor beschrieben durchgeführt [9]. Kurz gesagt, 0,45 ml PRP werden in eine Küvette überführt und 3 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Dann werden 0,05 ml des Agonisten in das PRP gegeben und man lässt das Aggregationsmuster 6 Minuten lang entstehen. Die Thrombozytenaggregation wurde als maximale prozentuale Änderung der Lichtdurchlässigkeit gegenüber dem Ausgangswert unter Verwendung von PPP als Referenz bestimmt. Der Cut-off-Wert von > 59 % Aggregation nach 20 microM ADP-Stimulation wird als der Wert definiert, der auf eine hohe Thrombozytenreaktivität während der Behandlung hinweist [10]. Weitere getestete Parameter sind die späte Aggregation und der Grad der Disaggregation.

Multiple-Elektroden-Aggregometrie (MEA) Die Thrombozytenaggregation im Vollblut wird durch MEA unter Verwendung eines Impedanz-Aggregometers (Multiplate, Dynabyte, München, Deutschland) beurteilt. Die Proben werden in Röhrchen mit 3,2 % Citrat gesammelt und innerhalb von einer halben bis zwei Stunden nach der Blutentnahme gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert. Die Thrombozytenaggregation wird durch ADP in einer Endkonzentration von 6,5 μM induziert. Jede Einweg-Testzelle enthält zwei Elektrodenpaare und ermöglicht so zwei gleichzeitige Messungen. Die Aggregation wird als Fläche unter der Kurve (AUC) angegeben, ein integriertes Maß für die Aggregationsgeschwindigkeit und die maximale Aggregation. Der Cut-off-Wert für HRPR durch MEA (> 468 willkürliche Aggregationseinheiten/Minute als Reaktion auf ADP durch Multiplate-Analysator) wurde gemäß der kürzlich veröffentlichten Konsenserklärung zur Definition einer hohen Thrombozytenreaktivität während der Behandlung gegenüber Adenosindiphosphat definiert [11].

Statistische Methoden

1. Primärer Endpunkt:

   In dieser prospektiven Kohortenstudie wird der primäre Endpunkt als eine Kombination aus Tod aufgrund kardiovaskulärer Ursachen, nichttödlichem Myokardinfarkt, Stentthrombose, ischämischem Schlaganfall, dringender Rehospitalisierung wegen akutem Koronarsyndrom und/oder Revaskularisierung während der einjährigen Nachbeobachtung definiert Zeitraum. Episoden schwerer Blutungen gemäß PLATO-Kriterien werden während der Nachuntersuchung aufgezeichnet.

2. Beschreibende Statistik:

   Sie werden als Mittelwerte ± SD, Mediane und Interquartilbereiche (IQR) oder gegebenenfalls als Prozentsätze dargestellt.

3. Vergleich der Basisdaten (demografische Daten, Krankengeschichte, kardiovaskuläre Risikofaktoren, hämatologische Parameter, Anzahl erkrankter Gefäße, früherer Myokardinfarkt, frühere Revaskularisation, Ejektionsfraktion und Begleitmedikation) zwischen Respondern und Non-Respondern auf Clopidogrel:

   Zunächst verwenden wir den Shapiro-Wilk-Test, um die Normalität der Datenverteilungen zu überprüfen. Kontinuierliche Variablen werden mit dem Student-t-Test mit zwei Stichproben (wenn die Verteilung als normal befunden wird) oder mit dem nichtparametrischen Wilcoxon-Rangsummentest (Mann-Whitney) mit zwei Stichproben (wenn die Verteilung gefunden wird) verglichen nicht normal). Kategoriale Variablen werden mit dem Chi-Quadrat-Test nach Pearson verglichen.

4. Übereinstimmung der beiden Methoden zum Nachweis einer Resistenz gegen Clopidogrel:

   Die Übereinstimmung zwischen „Multiplate“ und „ADP-induzierter LTA“ wird durch die Kappa-Statistik und die jeweiligen p-Werte bestimmt. Kappa-Werte von < 0,20 gelten als Anzeichen für eine schlechte Übereinstimmung, 0,21 bis 0,40 als mittelmäßige Übereinstimmung, 0,41 bis 0,60 als mäßige Übereinstimmung, 0,61 bis 0,80 als gute Übereinstimmung und > 0,81 als sehr gute Übereinstimmung.

5. Korrelation der Laborresistenz mit dem klinischen Ergebnis:

   Eine logistische Regressionsanalyse wird verwendet, um zu bewerten, ob die Methoden zum Nachweis einer Resistenz gegen Clopidogrel („Multiplate“ und „ADP-induzierte LTA“) mit dem klinischen Ergebnis (Endpunkt) zusammenhängen. Um zu beurteilen, ob diese Zusammenhänge unabhängig sind, werden bestimmte Kovariaten, die bekannte Risikofaktoren sind (z. B. kardiovaskuläre Risikofaktoren, Anzahl erkrankter Gefäße, früherer Myokardinfarkt, frühere Revaskularisation usw.), in die multivariablen logistischen Regressionsmodelle einbezogen. Es werden die rohen und angepassten Odds Ratios (ORs) sowie die entsprechenden 95 %-Konfidenzintervalle (CIs) dargestellt.

6. Signifikanzniveau:

   Für Hypothesentests wird ein Wahrscheinlichkeitsniveau von < 0,05 als statistisch signifikant angesehen. Alle statistischen Tests werden zweiseitig sein.

7. Statistiksoftware:

   Für alle statistischen Analysen wird Stata-Software verwendet (Stata Corp., College Station, TX, USA).

8. Berechnung der Stichprobengröße:

Für die Berechnung der Stichprobengröße der Studie nehmen wir an, dass die Clopidogrel-Resistenz CR(+) bei T2DM-Patienten häufiger vorkommt als bei Nicht-DM-Patienten [12, 13]; Gleichzeitig besteht in der DM-Gruppe von Patienten mit Clopidogrel-Resistenz ein erhöhtes Risiko unerwünschter kardiovaskulärer Ereignisse [14]. Es hat sich gezeigt, dass 13 % der Allgemeinbevölkerung von T2DM-Patienten ein schwerwiegendes unerwünschtes kardiovaskuläres Ereignis (MACE) erleiden [einschließlich Tod infolge einer kardiovaskulären Ursache, ST-Strecken-Hebungsinfarkt (STEMI), Myokardinfarkt ohne ST-Strecken-Hebung ( NSTEMI) und instabile Angina pectoris (UA) und Schlaganfall]; Bei T2DM-Patienten mit Clopidogrel-Resistenz, die weiterhin Clopidogrel-Behandlung erhalten, steigt diese Zahl auf 38 % [15]. Die Stichprobengröße, die erforderlich ist, um diesen Unterschied in den unerwünschten Ereignisraten zu erkennen – zwischen CR(+)- und CR(-)-Diabetikern – mit einem zweiseitigen a-Risiko von 5 % und einem b-Risiko von 20 % (Potenz von 80 %). 101 Patienten [40 in der CR(+)-Gruppe und 61 in der CR(-)-Gruppe]. Wenn wir von einer Fluktuationsrate von 10 % ausgehen, sollte die Stichprobengröße weiter auf 111 Patienten erhöht werden [44 in der CR(+)-Gruppe und 67 in der CR(-)-Gruppe]. Wenn man schließlich berücksichtigt, dass die Clopidogrel-Resistenz bei T2DM-Patienten schätzungsweise etwa 40 % erreicht [16-18], sollte die anfängliche Stichprobe aller Diabetiker 2,5-mal größer sein, also 278 Patienten (111 Clopidogrel-resistente und 167 Clopidogrel-resistente Patienten). empfindlich). Die Statistiksoftware G*Power 3.1.3 (Kiel, Deutschland) wurde zur Berechnung der Stichprobengröße herangezogen.