Aggregometria a più elettrodi e resistenza al clopidogrel

Lo scopo di questo studio è valutare la capacità di un nuovo dispositivo POC, l'aggregometria a elettrodi multipli (Multiplate, Dynabyte, Monaco, Germania) di rilevare la resistenza al clopidogrel e prevedere l'esito clinico in pazienti con diabete mellito di tipo 2 (T2DM) e malattia coronarica arteriopatia (CAD) rispetto all'aggregometria della trasmissione della luce (LTA), che è considerata il gold standard dei test di funzionalità piastrinica [7]. 280 pazienti con T2DM di età compresa tra 20 e 75 anni trattati con terapia ipoglicemizzante orale e/o parenterale per almeno 1 mese e malattia coronarica accertata angiograficamente sulla base di un precedente sopraslivellamento del tratto ST, sindrome coronarica acuta senza sopraslivellamento del tratto ST o angina instabile saranno reclutati trattati con clopidogrel 75 mg/die in combinazione con terapia giornaliera di aspirina per os per almeno 7 giorni dopo la documentazione di CAD. L'arruolamento dei pazienti avverrà presso il Secondo Dipartimento Universitario di Cardiologia dell'Ospedale Universitario "Attiko" di Atene, in Grecia. La valutazione di base includerà la registrazione di dati demografici, anamnesi, fattori di rischio cardiovascolare, parametri ematologici, numero di vasi malati, numero di vasi con stent, precedente infarto miocardico (MI), precedente rivascolarizzazione, frazione di eiezione e farmaci concomitanti. Pazienti con insufficienza renale (livelli di creatinina > 2,5 mg/dl) o epatica (livello di bilirubina > 2 mg/dl), malattia maligna, uso di farmaci noti per influenzare la funzione piastrinica, anamnesi di diatesi emorragica, conta piastrinica < 100x109/l e ematocrito < 28% sarà escluso. Il protocollo sarà approvato dal comitato di revisione istituzionale dell'Ospedale Universitario "Attiko" e tutti i pazienti forniranno il consenso informato scritto prima di sottoporsi a qualsiasi procedura di studio o ricevere qualsiasi trattamento di studio.

Le misurazioni della funzione piastrinica verranno eseguite all'arruolamento nello studio. I pazienti saranno identificati come responsivi scarsi o buoni al clopidogrel. L'endpoint primario sarà definito come un composito di morte per cause cardiovascolari, infarto miocardico non fatale, trombosi dello stent, ictus ischemico, riospedalizzazione urgente per sindrome coronarica acuta e/o rivascolarizzazione durante il periodo di follow-up di 1 anno. Gli episodi di sanguinamento maggiore secondo i criteri PLATO saranno registrati durante il follow-up [8].

Verrà valutata la capacità dei due metodi di rilevare la resistenza al clopidogrel e verrà valutata la potenziale correlazione tra la risposta al trattamento antipiastrinico e l'esito clinico. Parallelamente, i pazienti con caratteristiche simili, ma trattati con prasugrel o ticagrelor, saranno utilizzati come gruppo di controllo della stessa dimensione del campione.

Analisi della funzione piastrinica L'analisi della funzione piastrinica sarà eseguita presso il Laboratorio di Ematologia e Unità di Banca del sangue dell'Ospedale Universitario "Attiko". I campioni di sangue verranno prelevati da una vena antecubitale da 2 a 4 ore dopo l'assunzione della terapia antipiastrinica. I primi 2-4 ml di sangue verranno scartati per evitare l'attivazione piastrinica spontanea e i test di funzionalità piastrinica verranno eseguiti entro due ore dal prelievo.

Aggregometria a trasmissione luminosa (LTA) Il campione di sangue intero sarà raccolto in citrato trisodico al 3,8% e centrifugato a 200 g per 10 minuti per ottenere plasma ricco di piastrine (PRP). Il restante campione sarà nuovamente centrifugato a 2000 g per 15 minuti per ottenere plasma povero di piastrine (PPP). La conta piastrinica sarà regolata tra 200.000/μl e 300.000/μl con PPP. L'aggregazione sarà eseguita utilizzando un aggregometro Biodata-PAP-4 (Bio/Data Corporation, PA, USA). La linea del 100% verrà impostata utilizzando PPP e una linea di base dello 0% stabilita con PRP prima dell'aggiunta dell'agonista. L'agonista utilizzato sarà ADP 2.0×10-5 M (Bio/Data Corporation, PA, USA). La procedura di test sarà eseguita come descritto in precedenza [9]. In breve, 0,45 mL di PRP vengono trasferiti in una cuvetta incubata a 37 °C per 3 minuti. Quindi si aggiungono 0,05 mL dell'agonista nel PRP e si lascia generare il modello di aggregazione per 6 minuti. L'aggregazione piastrinica è stata determinata come variazione percentuale massima della trasmittanza della luce rispetto al basale utilizzando PPP come riferimento. Il valore di cut-off di > 59% di aggregazione dopo stimolazione con 20 microM di ADP sarà definito come quello che indica un'elevata reattività piastrinica durante il trattamento [10]. Altri parametri testati saranno l'aggregazione tardiva e il grado di disaggregazione.

Aggregometria a elettrodi multipli (MEA) L'aggregazione piastrinica nel sangue intero sarà valutata mediante MEA utilizzando un aggregometro ad impedenza (Multiplate, Dynabyte, Monaco, Germania). I campioni verranno raccolti in provette di citrato al 3,2% e analizzati entro un periodo da mezz'ora a due ore dopo il prelievo del sangue secondo le istruzioni del produttore. L'aggregazione piastrinica sarà indotta dall'ADP in concentrazione finale 6.5 μM. Ogni cella di test usa e getta contiene due coppie di elettrodi, consentendo così due misurazioni simultanee. L'aggregazione sarà riportata come area sotto la curva (AUC), una misura integrata della velocità di aggregazione e dell'aggregazione massima. Il valore di cut-off per HRPR mediante MEA (> 468 unità di aggregazione arbitraria/min in risposta all'ADP mediante analizzatore Multiplate) è stato definito secondo la dichiarazione di consenso recentemente pubblicata sulla definizione di elevata reattività piastrinica durante il trattamento all'adenosina difosfato [11].

Metodi statistici

1. Punto finale principale:

   In questo studio prospettico di coorte, l'endpoint primario sarà definito come un composito di morte per cause cardiovascolari, infarto miocardico non fatale, trombosi dello stent, ictus ischemico, riospedalizzazione urgente per sindrome coronarica acuta e/o rivascolarizzazione durante il follow-up di 1 anno periodo. Gli episodi di sanguinamento maggiore secondo i criteri PLATO verranno registrati durante il follow-up.

2. Statistiche descrittive:

   Saranno presentati come medie ± SD, mediane e intervalli interquartili (IQR) o percentuali, se del caso.

3. Confronto dei dati al basale (dati demografici, anamnesi, fattori di rischio cardiovascolare, parametri ematologici, numero di vasi malati, precedente infarto miocardico, precedente rivascolarizzazione, frazione di eiezione e farmaci concomitanti) tra responder e non responder a clopidogrel:

   Innanzitutto, utilizzeremo il test di Shapiro-Wilk per verificare la normalità delle distribuzioni dei dati. Le variabili continue saranno confrontate mediante il test t di Student a due campioni (quando la distribuzione è trovata normale) o mediante il test Wilcoxon rank-sum (Mann-Whitney) a due campioni non parametrico (quando la distribuzione è trovata normale) non normale). Le variabili categoriali saranno confrontate utilizzando il test del chi quadrato di Pearson.

4. Concordanza dei due metodi nel rilevare la resistenza al clopidogrel:

   L'accordo tra "Multiplate" e "ADP-indotto LTA" sarà determinato dalla statistica kappa e dai rispettivi p-value. Valori kappa < 0,20 sono considerati indicare uno scarso accordo, da 0,21 a 0,40 indicano un discreto accordo, da 0,41 a 0,60 indicano un accordo moderato, da 0,61 a 0,80 indicano un buon accordo e >0,81 indicano un accordo molto buono.

5. Correlazione della resistenza di laboratorio con l'esito clinico:

   Verrà utilizzata l'analisi di regressione logistica per valutare se i metodi di rilevamento della resistenza a clopidogrel ("Multiplate" e "ADP-indotto LTA") sono associati all'esito clinico (end-point). Per valutare se queste associazioni sono indipendenti, alcune covariate che sono fattori di rischio ben noti (cioè fattori di rischio cardiovascolare, numero di vasi malati, precedente infarto miocardico, precedente rivascolarizzazione, ecc.) saranno incluse nei modelli di regressione logistica multivariata. Verranno presentati gli odds ratio (OR) grezzi e corretti e i corrispondenti intervalli di confidenza al 95% (IC).

6. Livello di significatività:

   Per la verifica delle ipotesi, un livello di probabilità < 0,05 sarà considerato statisticamente significativo. Tutti i test statistici saranno bilaterali.

7. Software statistico:

   Il software Stata verrà utilizzato per tutte le analisi statistiche (Stata Corp., College Station, TX, USA).

8. Calcolo della dimensione del campione:

Per il calcolo della dimensione del campione dello studio, ipotizziamo che la resistenza al clopidogrel CR(+) sia più prevalente tra i pazienti con T2DM rispetto ai pazienti non-DM [12, 13]; allo stesso tempo, il gruppo DM di pazienti con resistenza al clopidogrel soffre di una maggiore probabilità di eventi avversi cardiovascolari [14]. È stato dimostrato che il 13% della popolazione generale dei pazienti con T2DM soffre di un evento cardiovascolare avverso maggiore (MACE) [tra cui morte secondaria a causa cardiovascolare, infarto del miocardio con sopraslivellamento del tratto ST (STEMI), infarto del miocardio senza sopraslivellamento del tratto ST ( NSTEMI) e angina instabile (UA) e ictus]; questo numero aumenta al 38% tra i pazienti con T2DM con resistenza a clopidogrel che rimangono in trattamento con clopidogrel [15]. La dimensione del campione necessaria per rilevare questa differenza nei tassi di eventi avversi - tra pazienti diabetici CR(+) e CR(-) - con un rischio bilaterale del 5% e un rischio b del 20% (potenza dell'80%) avrà essere 101 pazienti [40 nel gruppo CR(+) e 61 nel gruppo CR(-)]. Se assumiamo un tasso di abbandono del 10%, la dimensione del campione dovrebbe essere ulteriormente aumentata a 111 pazienti [44 nel gruppo CR(+) e 67 nel gruppo CR(-)]. Infine, considerando che si può stimare che la resistenza al clopidogrel tra i pazienti con T2DM raggiunga circa il 40% [16-18], il campione iniziale di tutti i pazienti diabetici dovrebbe essere 2,5 volte più grande, ovvero 278 pazienti (111 resistenti al clopidogrel e 167 resistenti al clopidogrel sensibile). Il software statistico G*Power 3.1.3 (Kiel, Germania) è stato utilizzato per il calcolo della dimensione del campione.