Agregometrie více elektrod a rezistence na clopidogrel

Cílem této studie je zhodnotit schopnost nového POC zařízení, víceelektrodové agregometrie (Multiplate, Dynabyte, Mnichov, Německo) detekovat rezistenci na klopidogrel a predikovat klinický výsledek u pacientů s diabetes mellitus 2. typu (T2DM) a koronární artery disease (CAD) ve srovnání s agregometrií propustnosti světla (LTA), která je považována za zlatý standard testování funkce krevních destiček [7]. 280 pacientů s T2DM ve věku 20 až 75 let léčených perorální a/nebo parenterální hypoglykemickou terapií po dobu alespoň 1 měsíce a angiograficky zjištěným onemocněním koronárních tepen na základě předchozí elevace ST, akutního koronárního syndromu bez elevace ST nebo nestabilní anginy pectoris léčeni klopidogrelem 75 mg/den v kombinaci s denní terapií aspirinem per os po dobu alespoň 7 dnů po dokumentaci ICHS. Zápis pacientů bude probíhat na II. univerzitní kardiologické klinice Fakultní nemocnice „Attiko“ v řeckých Aténách. Základní hodnocení bude zahrnovat zaznamenávání demografických údajů, anamnézy, kardiovaskulárních rizikových faktorů, hematologických parametrů, počtu nemocných cév, počtu stentovaných cév, předchozího infarktu myokardu (IM), předchozí revaskularizace, ejekční frakce a souběžné medikace. Pacienti s renální (hladina kreatininu > 2,5 mg/dl) nebo jaterní (hladina bilirubinu > 2 mg/dl) insuficiencí, maligním onemocněním, užíváním léků, o kterých je známo, že ovlivňují funkci krevních destiček, anamnézou krvácivé diatézy, počtem krevních destiček < 100x109/l a hematokrit < 28 % bude vyloučen. Protokol bude schválen institucionálním kontrolním výborem Fakultní nemocnice „Attiko“ a všichni pacienti dají písemný informovaný souhlas před tím, než podstoupí jakýkoli studijní postup nebo podstoupí jakoukoli studijní léčbu.

Měření funkce krevních destiček bude provedeno při zápisu do studie. Pacienti budou identifikováni jako slabí nebo dobře reagující na klopidogrel. Primární cílový ukazatel bude definován jako složený z úmrtí z kardiovaskulárních příčin, nefatálního infarktu myokardu, trombózy stentu, ischemické cévní mozkové příhody, urgentní rehospitalizace pro akutní koronární syndrom a/nebo revaskularizace během 1-letého období sledování. Epizody velkého krvácení podle kritérií PLATO budou zaznamenávány během sledování [8].

Bude hodnocena schopnost těchto dvou metod detekovat rezistenci na klopidogrel a posouzena potenciální korelace mezi odpovědí na protidestičkovou léčbu a klinickým výsledkem. Paralelně budou pacienti s podobnými charakteristikami, ale léčení prasugrelem nebo tikagrelorem, použiti jako kontrolní skupina o stejné velikosti vzorku.

Analýza funkce krevních destiček Analýza funkce krevních destiček bude provedena v Laboratoři hematologie a oddělení krevní banky Fakultní nemocnice "Attiko". Vzorky krve budou odebrány z antekubitální žíly 2 až 4 hodiny po podání protidestičkové terapie. První 2 až 4 ml krve budou zlikvidovány, aby se zabránilo spontánní aktivaci krevních destiček, a testy funkce krevních destiček budou provedeny do dvou hodin po odběru vzorků.

Agregometrie propustnosti světla (LTA) Vzorek plné krve bude odebrán do 3,8% citrátu trisodného a centrifugován při 200 g po dobu 10 minut, aby se získala plazma bohatá na krevní destičky (PRP). Zbývající vzorek bude znovu centrifugován při 2000 g po dobu 15 minut, aby se získala plazma chudá na destičky (PPP). Počet krevních destiček bude upraven na hodnotu mezi 200 000/μl a 300 000/μl s PPP. Agregace bude provedena pomocí agregometru Biodata-PAP-4 (Bio/Data Corporation, PA, USA). 100% linie se nastaví pomocí PPP a 0% základní linie se stanoví pomocí PRP před přidáním agonisty. Použitým agonistou bude ADP 2,0 x 10-5 M (Bio/Data Corporation, PA, USA). Zkušební postup bude proveden tak, jak bylo popsáno dříve [9]. Stručně řečeno, 0,45 ml PRP se přenese do kyvety inkubované při 37 °C po dobu 3 minut. Potom se do PRP přidá 0,05 ml agonisty a agregační vzor se nechá generovat po dobu 6 minut. Agregace krevních destiček byla stanovena jako maximální procentuální změna v propustnosti světla od základní hodnoty s použitím PPP jako reference. Hraniční hodnota > 59 % agregace po stimulaci 20 mikroM ADP bude definována jako hodnota indikující vysokou reaktivitu krevních destiček při léčbě [10]. Dalšími testovanými parametry bude pozdní agregace a míra disagregace.

Agregometrie s více elektrodami (MEA) Agregace krevních destiček v plné krvi bude hodnocena pomocí MEA pomocí impedančního agregometru (Multiplate, Dynabyte, Mnichov, Německo). Vzorky budou odebírány do 3,2% citrátových zkumavek a analyzovány během půl až dvou hodin po odběru krve podle pokynů výrobce. Agregace krevních destiček bude indukována ADP v konečné koncentraci 6,5 μM. Každá testovací buňka na jedno použití obsahuje dva páry elektrod, což umožňuje dvě současná měření. Agregace bude hlášena jako plocha pod křivkou (AUC), integrovaná míra rychlosti agregace a maximální agregace. Hraniční hodnota pro HRPR pomocí MEA (> 468 arbitrárních agregačních jednotek/min v odpovědi na ADP pomocí Multiplate analyzátoru) byla definována podle nedávno publikovaného konsenzuálního prohlášení o definici vysoké reaktivity destiček na adenosindifosfát při léčbě [11].

Statistické metody

1. Primární koncový bod:

   V této prospektivní kohortové studii bude primární cíl definován jako složený z úmrtí z kardiovaskulárních příčin, nefatálního infarktu myokardu, trombózy stentu, ischemické cévní mozkové příhody, urgentní rehospitalizace pro akutní koronární syndrom a/nebo revaskularizace během 1letého sledování doba. Během sledování budou zaznamenávány epizody velkého krvácení podle kritérií PLATO.

2. Deskriptivní statistika:

   Budou prezentovány jako průměry ± SD, mediány a interkvartilní rozsahy (IQR), případně procenta.

3. Porovnání výchozích údajů (demografické údaje, zdravotní anamnéza, kardiovaskulární rizikové faktory, hematologické parametry, počet nemocných cév, předchozí infarkt myokardu, předchozí revaskularizace, ejekční frakce a souběžná medikace) mezi pacienty, kteří na klopidogrel reagovali, a pacienty, kteří nereagovali:

   Nejprve použijeme Shapiro-Wilkův test ke kontrole normality distribuce dat. Spojité proměnné budou porovnávány pomocí dvouvýběrového Studentova t testu (při zjištění normálního rozdělení) nebo pomocí neparametrického dvouvýběrového Wilcoxonova rank-sum testu (Mann-Whitney) (při zjištění rozdělení nenormální). Kategorické proměnné budou porovnány pomocí Pearsonova chí-kvadrát testu.

4. Shoda dvou metod při zjišťování rezistence na klopidogrel:

   Shoda mezi "Multiplate" a "ADP-indukovaná LTA" bude určena statistikou kappa a příslušnými hodnotami p. Hodnoty kappa < 0,20 jsou považovány za indikaci špatné shody, 0,21 až 0,40 značí dobrou shodu, 0,41 až 0,60 značí střední shodu, 0,61 až 0,80 značí dobrou shodu a >0,81 značí velmi dobrou shodu.

5. Korelace laboratorní rezistence s klinickým výsledkem:

   Logistická regresní analýza bude použita k vyhodnocení, zda metody detekce rezistence na klopidogrel ("Multiplate" a "ADP-indukovaná LTA") jsou spojeny s klinickým výsledkem (end-point). Pro vyhodnocení, zda jsou tyto asociace nezávislé, budou do multivariabilních logistických regresních modelů zahrnuty určité kovariáty, které jsou dobře známými rizikovými faktory (tj. kardiovaskulární rizikové faktory, počet nemocných cév, předchozí infarkt myokardu, předchozí revaskularizace atd.). Budou prezentovány hrubé a upravené poměry šancí (OR) a odpovídající 95% intervaly spolehlivosti (CI).

6. Úroveň významnosti:

   Pro testování hypotéz bude hladina pravděpodobnosti < 0,05 považována za statisticky významnou. Všechny statistické testy budou oboustranné.

7. Statistický software:

   Pro všechny statistické analýzy bude použit software Stata (Stata Corp., College Station, TX, USA).

8. Vzorový výpočet velikosti:

Pro výpočet velikosti vzorku ve studii předpokládáme, že rezistence na klopidogrel CR(+) je častější mezi pacienty s T2DM ve srovnání s pacienty bez DM [12, 13]; zároveň skupina pacientů s DM s rezistencí na klopidogrel trpí zvýšenou pravděpodobností nežádoucích kardiovaskulárních příhod [14]. Ukázalo se, že 13 % obecné populace pacientů s T2DM trpí závažnou nepříznivou kardiovaskulární příhodou (MACE) [včetně úmrtí sekundárního z kardiovaskulární příčiny, infarktu myokardu s elevací ST segmentu (STEMI), infarktu myokardu bez elevace ST segmentu ( NSTEMI) a nestabilní angina pectoris (UA) a cévní mozková příhoda]; toto číslo se zvyšuje na 38 % u pacientů s T2DM s rezistencí na klopidogrel, kteří zůstávají na léčbě klopidogrelem [15]. Velikost vzorku potřebná k detekci tohoto rozdílu v četnosti nežádoucích příhod – mezi pacienty s diabetem CR(+) a CR(-) – s oboustranným rizikem 5 % a rizikem b 20 % (moc 80 %) bude mít být 101 pacientů [40 ve skupině CR(+) a 61 ve skupině CR(-)]. Pokud předpokládáme míru atrice 10 %, velikost vzorku by se měla dále zvýšit na 111 pacientů [44 ve skupině CR(+) a 67 ve skupině CR(-)]. A konečně, vezmeme-li v úvahu, že rezistence na klopidogrel mezi pacienty s T2DM lze odhadnout na přibližně 40 % [16–18], počáteční vzorek všech pacientů s diabetem by měl být 2,5krát větší, tj. 278 pacientů (111 rezistentních na klopidogrel a 167 pacientů s klopidogrelem- citlivý). Statistický software G*Power 3.1.3 (Kiel, Německo) byl použit pro výpočet velikosti vzorku.