複数電極凝集測定とクロピドグレル耐性

この研究の目的は、クロピドグレル耐性を検出し、2 型糖尿病 (T2DM) および冠状動脈疾患患者の臨床転帰を予測するための、新しい POC デバイスである複数電極凝集測定装置 (Multiplate、Dynabyte、ドイツ、ミュンヘン) の能力を評価することです。動脈疾患（CAD）と血小板機能検査のゴールドスタンダードと考えられている光透過凝集測定法（LTA）との比較[7]。 少なくとも1か月間、経口および/または非経口血糖降下療法を受け、以前のST上昇、非ST上昇の急性冠症候群または不安定狭心症を理由に血管造影により冠動脈疾患が確立された20～75歳のT2DM患者280名CADの文書化後少なくとも7日間、毎日の経口アスピリン療法と組み合わせてクロピドグレル75mg/日で治療された患者が募集される。 患者の登録は、ギリシャのアテネにある「アッティコ」大学病院の第二大学循環器科で行われます。 ベースライン評価には、人口統計データ、病歴、心血管危険因子、血液学的パラメーター、罹患血管の数、ステント留置血管の数、以前の心筋梗塞（MI）、以前の血行再建術、駆出率、および併用薬の記録が含まれます。 腎臓（クレアチニンレベル > 2.5 mg/dl）または肝臓（ビリルビンレベル > 2 mg/dL）機能不全、悪性疾患、血小板機能に影響を与えることが知られている薬剤の使用、出血素因の既往歴、血小板数 < 100x109/L、およびヘマトクリット < 28% は除外されます。 このプロトコールは「アティコ」大学病院の治験審査委員会によって承認され、すべての患者は研究手順を受ける前、または研究治療を受ける前に書面によるインフォームドコンセントを提出します。

血小板機能測定は研究登録時に実施されます。 患者は、クロピドグレルに対する反応が不良か良好かのいずれかとして識別されます。 主要エンドポイントは、心血管疾患による死亡、非致死性心筋梗塞、ステント血栓症、虚血性脳卒中、急性冠症候群による緊急再入院、および/または1年間の追跡期間中の血行再建術の複合として定義される。 PLATO 基準による大出血のエピソードは追跡調査中に記録されます [8]。

クロピドグレル耐性を検出する 2 つの方法の能力が評価され、抗血小板治療に対する反応と臨床転帰の間の潜在的な相関関係が評価されます。 並行して、同様の特徴を持つがプラスグレルまたはチカグレロルで治療された患者を、同じサンプルサイズの対照群として使用します。

血小板機能分析 血小板機能分析は、「アッティコ」大学病院の血液学および血液銀行部門の研究室で行われます。 血液サンプルは、抗血小板療法摂取の 2 ～ 4 時間後に肘前静脈から採取されます。 自然発生的な血小板活性化を避けるために、最初の 2 ～ 4 ml の血液は廃棄され、血小板機能検査はサンプリング後 2 時間以内に実行されます。

光透過率凝集測定法 (LTA) 全血検体を 3.8% クエン酸三ナトリウム中に収集し、200 g で 10 分間遠心分離して、多血小板血漿 (PRP) を取得します。 残りの検体を 2000 g で 15 分間再遠心分離して、乏血小板血漿 (PPP) を取得します。 血小板数は PPP により 200,000/μl ～ 300,000/μl の間に調整されます。 凝集は、Biodata-PAP-4 凝集計 (Bio/Data Corporation、ペンシルベニア州、米国) を使用して実行されます。 100% ラインは PPP を使用して設定され、0% ベースラインはアゴニストの添加前に PRP で確立されます。 使用されるアゴニストは、ADP 2.0×10-5 M (Bio/Data Corporation、ペンシルベニア州、米国) です。 テスト手順は以前に説明したように実行されます [9]。 簡単に説明すると、0.45 mL の PRP をキュベットに移し、37 °C で 3 分間インキュベートします。 次に、0.05 mL のアゴニストを PRP に添加し、6 分間凝集パターンを生成させます。 血小板凝集は、PPPを参照として使用し、ベースラインからの光透過率の最大変化パーセントとして決定されました。 20 microM ADP 刺激後の凝集率 > 59% のカットオフ値は、治療中の血小板反応性が高いことを示す値として定義されます [10]。 テストされるその他のパラメータは、後期凝集と離散の程度です。

多重電極凝集測定法（MEA） 全血中の血小板凝集は、インピーダンス凝集計（Multiplate、Dynabyte、ミュンヘン、ドイツ）を使用する MEA によって評価されます。 サンプルは 3.2% クエン酸チューブに収集され、メーカーの指示に従って採血後 30 分から 2 時間以内に分析されます。 血小板凝集は、最終濃度 6.5 μM の ADP によって誘導されます。 各使い捨てテストセルには 2 対の電極が含まれているため、2 つの同時測定が可能です。 凝集は、凝集速度と最大凝集の総合的な尺度である曲線下面積 (AUC) として報告されます。 MEA による HRPR のカットオフ値 (マルチプレート アナライザーによる ADP に応答した任意の凝集単位 > 468 単位/分) は、アデノシン二リン酸に対する治療中の血小板の高い反応性の定義に関する最近発表されたコンセンサス ステートメントに従って定義されました [11]。

統計的手法

1. 主要エンドポイント:

   この前向きコホート研究では、主要評価項目は、心血管疾患による死亡、非致死性心筋梗塞、ステント血栓症、虚血性脳卒中、急性冠症候群による緊急再入院、および/または1年間の追跡調査中の血行再建術の複合として定義される。期間。 PLATO 基準に従った大出血のエピソードは追跡調査中に記録されます。

2. 記述統計:

   これらは、必要に応じて、平均値 ± SD、中央値および四分位範囲 (IQR)、またはパーセンテージとして表示されます。

3. クロピドグレルに対する反応者と非反応者のベースラインデータ（人口統計データ、病歴、心血管危険因子、血液学的パラメーター、罹患血管の数、以前の心筋梗塞、以前の血行再建術、駆出率および併用薬）の比較：

   まず、Shapiro-Wilk 検定を使用してデータ分布の正規性を確認します。 連続変数は、2 サンプルのスチューデント t 検定 (分布が正規であることが判明した場合) またはノンパラメトリック 2 サンプルのウィルコクソン順位和 (マン-ホイットニー) 検定 (分布が見つかった場合) によって比較されます。正常ではありません）。 カテゴリ変数は、ピアソンのカイ二乗検定を使用して比較されます。

4. クロピドグレルに対する耐性の検出における 2 つの方法の一致:

   「マルチプレート」と「ADP 誘発 LTA」の間の一致は、カッパ統計量とそれぞれの p 値によって決定されます。 カッパ値 < 0.20 は一致が不十分であることを示し、0.21 ～ 0.40 はかなり一致していることを示し、0.41 ～ 0.60 は中程度の一致を示し、0.61 ～ 0.80 は良好な一致を示し、>0.81 は非常に良好な一致を示します。

5. 臨床検査耐性と臨床転帰の相関:

   ロジスティック回帰分析は、クロピドグレルに対する耐性を検出する方法（「マルチプレート」および「ADP誘発LTA」）が臨床転帰（エンドポイント）と関連しているかどうかを評価するために使用されます。 これらの関連性が独立しているかどうかを評価するために、よく知られている危険因子である特定の共変量 (つまり、心血管危険因子、罹患血管の数、以前の心筋梗塞、以前の血行再建術など) が多変量ロジスティック回帰モデルに含まれます。 原油と調整後のオッズ比 (OR) および対応する 95% 信頼区間 (CI) が表示されます。

6. 重要度:

   仮説検定の場合、確率レベル < 0.05 は統計的に有意であるとみなされます。 すべての統計検定は両側検定になります。

7. 統計ソフトウェア:

   すべての統計分析には Stata ソフトウェアが使用されます (Stata Corp.、米国テキサス州カレッジステーション)。

8. サンプルサイズの計算:

研究サンプルサイズの計算では、クロピドグレル耐性 CR(+) は非 DM 患者と比較して T2DM 患者でより蔓延しているという仮説を立てます [12、13]。同時に、クロピドグレル耐性のあるDMグループの患者は、有害な心血管イベントの可能性が高くなります[14]。 T2DM 患者の一般人口の 13% が重大な心血管イベント (MACE) [心血管疾患による死亡、ST 上昇型心筋梗塞 (STEMI)、非 ST 上昇型心筋梗塞を含む) を患っていることが示されています。 NSTEMI)、不安定狭心症 (UA)、および脳卒中]。クロピドグレル耐性を有し、クロピドグレル治療を継続しているT2DM患者では、この数は38%に増加する[15]。 CR(+) と CR(-) の糖尿病患者間の有害事象発生率の違いを検出するために必要なサンプル サイズは、両側 a リスク 5%、b リスク 20% (検出力 80%) となります。患者数は 101 名 [CR(+) 群 40 名、CR(-) 群 61 名]。 減少率を 10% と仮定すると、サンプル サイズはさらに 111 名の患者 [CR(+) グループで 44 名、CR(-) グループで 67 名] に増加する必要があります。 最後に、T2DM 患者のクロピドグレル耐性が約 40% に達すると推定されることを考慮すると [16-18]、すべての糖尿病患者の最初のサンプルは 2.5 倍、つまり 278 名の患者 (クロピドグレル耐性 111 名、クロピドグレル耐性 167 名) である必要があります。センシティブ）。 統計ソフト G*Power 3.1.3 (キール、ドイツ) をサンプルサイズの計算に使用しました。