破解鸡蛋潜力：改善厄瓜多尔幼儿营养

目标

目标 1：测试六个月每天食用鸡蛋对厄瓜多尔土著社区幼儿常量和微量营养素状况的影响。

1a.测量微量营养素生物标志物的血清浓度：胆碱；甜菜碱；和维生素 B12。

1. b.测量常量营养素生物标志物的血清浓度：脂质（总游离和酯化）；和氨基酸。

   目标 2：描述补充喂养期间对鸡蛋的态度、信念和使用。

2. 一种。描述厄瓜多尔幼儿饮食中鸡蛋的现有态度、信念和用途。

2b.监测幼儿每天食用鸡蛋的可接受性和耐受性。

2c.评估看护人每天为幼儿准备和喂鸡蛋的意愿。

背景与意义

在全球范围内，有 1.65 亿儿童发育迟缓，部分原因是在补充喂养期间缺乏常量和微量营养素；定义为 6 至 24 个月大。 估计有 2 亿儿童未能发挥其发展潜力，部分原因是营养不良，尤其是营养摄入不足。 鸡蛋提供了生活在贫穷国家的幼儿饮食中所缺少的几种关键营养素，但在婴幼儿营养中基本上没有得到充分利用。

鸡蛋提供的必需脂肪酸、蛋白质和许多重要的微量营养素水平高于或与其他动物源食品相当，但相对更实惠。 鸡蛋被认为是一种完美的蛋白质来源，其氨基酸谱可与其他蛋白质进行比较。 鸡蛋还富含胆碱，胆碱是神经递质合成中乙酰胆碱的重要前体，细胞膜信号传导所需的磷脂，以及同型半胱氨酸生产途径中的甲基捐赠。 胆碱缺乏的不利后果的证据主要来自动物研究，尽管一些研究表明胆碱或其代谢物与儿童的负面健康和发育结果之间存在关联。 只有一项研究表明，可以通过咨询提高幼儿的鸡蛋消费量。

鸡蛋有助于饮食多样化。 它们是三个动物源食物组之一，与肉食和乳制品一起，包括在用于评估世卫组织评估婴幼儿喂养做法的指标中最低膳食多样性指标的七个食物组中。 然而，相对于它们改善儿童营养的潜力而言，它们在幼儿饮食中的使用不足，特别是在许多非洲国家，甚至在拉丁美洲和加勒比地区也是如此。 在非洲、亚洲和拉丁美洲，前一天 6 至 8.9 个月大的儿童的鸡蛋消费量分别仅为 7.3%、15.8% 和 22.8%。 在 12 至 23.9 个月大的儿童中，非洲的消费仅增长了 13.4%，亚洲为 33.0%，拉丁美洲和加勒比地区为 41.8%。

迄今为止的所有证据都表明，相对于鸡蛋改善幼儿营养，特别是关键常量和微量营养素水平的潜力，鸡蛋作为补充食品的利用不足。 需要进行研究来测试膳食鸡蛋摄入量对改善发展中国家儿童营养的功效。 还需要了解补充喂养期间对鸡蛋的态度、信念和使用。

意义。 尽管鸡蛋有改善幼儿营养的潜力，但据我们所知，还没有随机对照试验来测试食用鸡蛋对改善发展中国家幼儿微量营养素状况的功效，而且与鸡蛋相关的干预措施的证据也很少。 关于补充喂养期间母亲和其他看护者对鸡蛋的态度、信念和使用的证据也非常有限。 因此，拟议的研究将通过一项随机对照试验检查鸡蛋摄入量对血清微量营养素生物标志物浓度的影响，从而填补文献中的一个重要空白：B12；胆碱;甜菜碱和常量营养素生物标志物：脂质（总游离和酯化）；和厄瓜多尔贫困农村地区幼儿的蛋白质营养。 通过定性研究，拟议的研究还将阐明母亲和其他护理人员在补充喂养期间对鸡蛋的态度、信念和使用。

实验设计和方法

基多旧金山大学 (USFQ) 将协调所有实地活动。 将应用具有平行设计的随机对照试验。 本研究共纳入180对母婴：对照组90对；鸡蛋干预组为 90 人。 所有婴儿的纳入标准包括： 6-8 个月大；健康（无发烧、先天性心脏病或鸡蛋过敏）；单胎出生；并且没有严重营养不良 [身长别体重 z (WLZ) > -3)。 将有 180 名母亲参加，如果母亲不在，则其他照顾婴儿的人（父亲、祖父母、阿姨/叔叔、兄弟姐妹等）将报名参加。

参与者（招募、筛选和同意过程）。 厄瓜多尔科托帕希省的 Pastocalle 教区将招募母亲/主要照顾者和儿童，在那里进行形成性研究以确保该年龄段的婴儿数量充足。 将有一个为期一年的滚动录取过程，以确保达到样本量，并且我们可能会将招募范围扩大到邻近的教区。 在地方领导人的​​支持和社区利益相关者的积极参与下，将通过参与式方法招募参与者。 在招募之前会有一个初始阶段，现场团队将使用标准化技术与护理人员建立融洽关系。 将联系并邀请母亲（或其他主要照顾者）与他们的孩子一起参加研究。 研究人员将口头解释研究的基本原理、所有研究程序及其风险和益处，并将邀请母亲与孩子一起参与。 然后将进行资格筛选。 向母亲/主要看护人提出的筛选问题将包括：

• 你几岁？
• 孩子的生日是几号？
• 孩子是否健康，没有发烧或先天性心脏病，也没有严重营养不良？
• 孩子吃鸡蛋有没有反应，出现皮疹、荨麻疹、呼吸困难？
• 这个孩子的出生是单胎吗？他/她没有双胞胎或三胞胎等。

如果主要照顾者报告孩子营养不良和/或孩子出现消瘦或水肿等其他症状，将测量孩子的体重和身长，并根据 WHO 确定的身长别体重 Z 评分增长标准 (2006)。

儿童的母亲或主要照顾者将获得一份西班牙语的书面知情同意书，供其阅读和签署，表示同意并代表孩子同意。 如果母亲/主要照顾者未满 18 岁，将征得其父母或监护人的知情同意。 识字能力有限的参与者可以选择让他们朗读声明。 在此期间，将邀请护理人员询问有关研究性质的任何问题。 潜在参与者将有大约一周的时间来决定是否参加，从而有机会与家人和朋友讨论。

研究现场程序。 儿童将通过计算机生成的数字序列程序以 1:1 的比例随机分配到两个比较组之一：1) 对照组； 2) 鸡蛋补充剂。

基线调查将首先在指定日期对社区中心、医疗站或托儿所的所有母亲/主要照顾者进行。 将收集家庭层面的社会经济、人口、水、卫生和环境卫生信息。 将使用常用辅食的食物频率问卷收集儿童膳食摄入量数据，并辅以有关儿童和家庭鸡蛋消费模式的针对性问题。 发病率将通过两周的召回进行评估，特别关注呼吸道感染，因为它在这一人群中患病率很高，而且任何症状都可能与鸡蛋过敏有关。 然后将使用国际协议对儿童身高和体重进行人体测量。 来自厄瓜多尔经验丰富且设备齐全的实验室 NETLAB 的抽血师将从儿童身上采集 3 毫升血液。 将为孩子们使用麻醉霜。

鸡蛋补充组的母亲每周会得到一份鸡蛋，并指示每天给孩子一个鸡蛋。 将传达有关卫生习惯以及鸡蛋处理和准备的其他信息。 鸡蛋不需要冷藏，但需要存放在阴凉的地方。 干预研究完成后，对照组的母亲/看护者将获得 6 个月卵子的代金券。 所有母亲都将收到一张考勤卡，该卡将跟踪研究活动的参与情况，包括基线和终点访问以及适当的定性评估。 研究完成后，所有母亲都会收到一份小的个人护理礼物（乳液或香水），以感谢她们的贡献。

研究协调员和团队将定期举办激励研讨会，以接收参与者的反馈，并继续为参与研究提供理由。 这些研讨会有效地让护理人员参与研究，并可以最大限度地减少后续损失。 此外，还将定期与社区领袖和卫生工作者举行会议，就研究进展和结果进行交流和对话。

鸡蛋将在帕斯托卡勒当地购买，并由研究团队每周分发给家庭。 （粮食及农业组织 (FAO) 可能会支持 USFQ 实施与本研究相关的家禽开发项目。 在农业部推广人员的技术支持下，Pastocalle 的家庭将接收和饲养用于下蛋的鸡。） 用于这项研究的鸡蛋将从这些家庭购买，并且通过教区委员会开发了一个已经建立的鸡蛋生产项目，以支持残疾人。

研究协调员和普查员团队将通过手机、访问以及通过家人和朋友联系失访的母亲/主要看护人，以鼓励他们返回研究并收集有关他们离开的原因的信息研究。

营养生物标志物：为本研究评估的营养生物标志物将包括维生素 B12、胆碱、甜菜碱、脂质和氨基酸。 位于厄瓜多尔基多的 NETLAB 将负责：1) 采集血样； 2）加工完成胆碱/甜菜碱、脂类和氨基酸的提取工艺； 3) 将这些样品运送到华盛顿大学生物医学质谱资源设施；和 4) 完成维生素 B12 的测定。 训练有素的抽血师将定期前往帕斯托卡勒和周边教区收集血液样本（每个孩子 3 毫升）。 乙二胺四乙酸 (EDTA) 血浆将通过将血液收集到仅标有参与者 ID 号的真空采血管中获得。 样品将被置于冰上并运送到基多的 NETLAB 设施。

将处理样品并完成胆碱、甜菜碱、脂质和氨基酸的提取。 对于胆碱和甜菜碱分析物，将等份血浆与含有 d9-胆碱和​​ d9-甜菜碱的乙腈混合。 将乙腈提取物离心，将上清液转移至微量离心管中，并在氮气下干燥至完全。 微型离心管标有参与者 ID# 和收集日期。 还完成了用于处理脂质和氨基酸的提取过程。 然后，这些提取的样品将在干冰上通过 Globalex 运输公司运送到位于密苏里州圣路易斯的华盛顿大学生物医学质谱资源设施。 胆碱和甜菜碱测定将使用 LC/MS/MS 方案（附录 1）进行测试。 剩余的样品等分试样将在 -80 摄氏度下冷冻。稍后将使用竞争性化学发光酶免疫测定固相测试维生素 B12。

定性研究。 此处将应用与重点民族志研究 (FES) 类似的定性研究技术。 定性方法基于扎根理论。 扎根理论是一种独特的定性分析形式，因为它具有从收集数据的系统分析中构建理论的归纳方向。 将对母亲、祖母和其他照料者以及当地医疗保健提供者、社区领袖和鸡蛋生产商进行深入访谈和焦点小组讨论，以了解他们对鸡蛋在幼儿营养方面的态度、看法和用途。

将在同意的看护人和儿童保育中心的宅基地进行结构化观察，以检查环境因素、养鸡做法、辅食储存以及鸡蛋准备和喂养做法。 此外，我们结合三种方法来分析收集到的定性数据：分三个阶段编码；溯因推理；和计划生成。 这三者中，核心方法是分三阶段编码。 首先，开放式编码识别个人回应中的基本概念。 其次，轴向编码是通过从响应模式中出现的类别和属性的生成而开发的，并在类别和属性之间产生关系。 第三，选择性编码整合和提炼主要主题以及它们之间的相互关系。 编码将由 USFQ 在 UCD 和 PAHO 的调查人员的支持下进行，以进行三角测量以进行质量控制。

数据管理。 USFQ 将负责对在 Pastocalle 和 NETLAB（与加州大学戴维斯分校）收集的数据进行数据管理，而华盛顿大学将负责在生物医学质谱资源设施生成的数据。 数据输入将尽早开始并在整个研究过程中持续进行，以尽量减少错误并增加准确和全面报告的可能性。 当发现潜在错误或缺失数据时，管理人员将询问普查员和护理人员/母亲，以在数据集中提供适当的答复或解释性说明。 将对一组调查进行双重数据输入，以检查输入错误。

样本量和统计分析。 样本量是根据 6 个月期间血浆维生素 B12 浓度 59.4 pmol/L 的假设变化（与对照的差分）估算的，该变化基于之前补充维生素 B12 的其他发现和婴儿维生素 B12 状态的变异性. 之所以选择这种营养素来计算样本量，是因为有足够的数据可用于估计与将要研究的其他营养素相比，食用鸡蛋的变异性和潜在影响。 假设减员率为 20%，我们估计每组需要 90 名儿童。

首先将应用描述性统计来检查样本的特征，以及主要和次要结果。 然后将应用包括卡方检验和 t 检验在内的单变量检验来比较各试验组的特征，并检查基线和终点结果变量的横截面差异。 主要生物标志物结果（连续血清/血浆营养浓度标志物）和二次生长（LAZ、WAZ、WLZ）和发病率结果（腹泻天数）的纵向建模将使用具有随机效应的广义最小二乘法（GLS）进行。 Logit 模型将用于检查阈值结果（营养缺乏、发育迟缓、体重不足、消瘦、呼吸道感染等）的调整后几率。 所有关于鸡蛋功效的推理分析都将使用意向治疗。 使用 STATA 软件（版本 11.1；StataCorp，College Station，TX）进行定量数据分析。

对于定性数据分析，访谈记录将上传到 Nvivo10 软件并针对主题进行编码。 根据参与者在访谈中的反应，热门主题将细分为更详细的类别。 对这些类别和主题的分析揭示了访谈数据中的模式，这些模式构成了定性调查结果的基础。 对分析关键主题的两个研究组中的一部分访谈进行的框架矩阵分析将用于调查研究组之间响应的任何系统差异。

为了衡量微量营养素摄入量是否符合正常的充足水平，将使用全概率法。 与估计高于和低于阈值水平的摄入量的简单分界点方法相比，该方法可以更全面地估计整个摄入量分布的不足风险。 儿童微量营养素摄入量将通过减去参考分布的估计平均需要量 (EAR) 然后除以参考分布的 SD 来标准化。 所得数字将与标准正态分布进行比较，以获得不充分的概率、标准正态曲线下右侧的面积，并在整个样本中取平均值。

目标人群概况。 本研究的目标人群是来自厄瓜多尔科托帕希省帕斯托卡勒教区的 6-8 个月大的婴儿，该教区主要由土著社区居住。 国家健康和营养调查 Encuesta Natcional de Salud y Nutrición (ENSANUT-ECU) 的结果显示，全国 25.3% 的 0-5 岁儿童和 42.3% 的土著儿童发育迟缓 (HAZ<-2)。 这项研究的其他指标进一步证明了厄瓜多尔土著幼儿的营养脆弱性。 贫血 (41.6%)、锌缺乏症 (32.4%) 和维生素 A 缺乏症 (19.3%) 的患病率均超过全国平均水平，并且在 6-11 月龄组中最高。 ENSANUT-ECU 发现普通人群中蛋白质、铁和锌的营养摄入严重不足。 大米占饮食中近三分之一 (32.8%) 的能量，而动物源性食物的含量相对较低。 USFQ 进行了 Chispaz 研究，检查微量营养素粉的功效；这项研究是在帕斯托卡勒进行的。 因此，社区已经对研究有了理解和赞赏。

风险和收益。 与本研究相关的风险低于最低限度。 对鸡蛋过敏反应的风险很低；预计在幼儿中仅为 1% 至 2%。 大多数病例是轻微的，包括食用鸡蛋后不久出现的荨麻疹。 已知对鸡蛋过敏的儿童将被排除在研究之外，任何表现出任何过敏反应症状的儿童将被转诊接受治疗，并将被排除在未来参与该研究之外。 本研究的抽血存在很小的风险。 收集样本的研究小组将接受安全处理人类生物样本的良好培训，并将遵守与使用手套、无菌设备和酒精棉签清洁该区域相关的严格卫生规程。 同样，人们正在探索一种麻木霜作为一种选择，以尽量减少孩子的疼痛和母亲/看护者的心理困扰。 为了保密，将在私人环境中与护理人员进行访谈。

孩子们将通过参与这项研究直接受益，通过食用鸡蛋（一种高营养质量、营养丰富的食物）可能改善营养状况。 该研究涉及延迟干预设计，最终所有参与者都有机会接受卵子干预。 因此，所有参与者都有机会通过收到高质量的食物而受益。 在以食物为基础的可持续方法改善幼儿营养方面获得的知识对社会有潜在的好处。 在全球范围内，营养规划和政策在很大程度上依赖于使用单一营养素或多种营养素补充剂、微量营养素粉或进口加工辅食。 该项目旨在测试一种以食物为基础的方法，通过适合幼儿的高生物利用度基质中的鸡蛋提供营养。 此外，这些鸡蛋是在当地购买的，可能对该地区的经济发展产生积极影响。

隐私和保密。 同意、面谈、人体测量和抽血过程将在社区中心、医疗保健站或儿童托儿所进行——因为现场团队可能会确定教区每个地区的最合适位置。 空间足够大以确保机密性。 在这些设置中的每个设置中，单独的私人空间将被指定用于访谈和数据收集。 只会询问有关儿童营养的问题，以避免任何不必要的隐私侵犯。 将为每个同意和面谈过程分配额外的时间，以允许母亲/主要照顾者根据需要提出其他问题。 它们也靠近家庭，以方便母亲和护理人员的访问。 在某些情况下，现场团队会出于上述目的直接拜访参加者的家中。

知情同意书将包括提及可能将数据和血液样本用于未来研究，作为母亲/护理人员同意的可选内容。 基线调查中将包括两个问题，第一个问题是询问母亲/看护人是否同意他们的数据可用于未来的研究，第二个问题是询问母亲/看护人孩子的血液是否可用于未来的研究。

数据将以纸质形式收集，并将存储在 Instituto de Investigacion en Salud y Nutricion (ISYN) 办公室的上锁柜子中。 所有参与者都将被分配一个唯一的标识符，该标识符将写在所有研究表格上。 研究调查人员对个人身份信息的访问将仅限于 PI、高级研究团队和现场团队，用于参与者跟进和跟踪。 数据将由 USFQ 的研究团队输入。 加密的原始数据文件将使用受密码保护的存储设备或其他电子数据传输机制定期传输到华盛顿大学。 去识别化的数据集将与共同 PI 共享。 在厄瓜多尔，该研究将事先获得 USFQ 的 IRB（Comité de Bioética）和公共卫生部的批准。