严重脑外伤后口咽和直肠微生物群的演变 (BBAX)

研究协议：

观察性前瞻性队列研究。

病人

将包括因严重创伤而入住 ICU 的患者。 将研究两组严重创伤患者：

1. 孤立性严重创伤性脑损伤 (TBI) 患者：初始格拉斯哥昏迷量表 (GCS) ≤ 8 且 AISextrahead 评分≤3 的 TBI
2. 无 TBI 的严重外伤患者（AISextrahead 评分 > 3）

一组健康个体将作为对照人群。

预计每组总入组患者20例，健康对照者10例。

患者数据收集

对于每位患者，将收集以下数据：

• 人口统计数据：年龄、性别、身高、体重、入住 ICU 日期、简化急性生理学评分 II (SAPS II)、损伤严重程度评分 (ISS)、入住 ICU 时的简化损伤量表 (AIS)。
• 外伤相关数据：外伤相关器官损伤的数量和类型、初始 GCS、初始处理时瞳孔散大的存在。
• 对微生物群有潜在影响的因素：抗生素治疗、营养类型、药物（质子泵抑制剂、阿片类药物、镇静剂、儿茶酚胺、类固醇）、ICU 住院期间的手术程序。
• 进化：在 ICU 住院期间获得多重耐药菌，ICU 获得性感染。 机械通气持续时间、肾外排脓、ICU 住院时间、ICU 出院时和创伤后 90 天时通过残疾评定量表 (DRS-F) 评估的神经学结果、ICU 出院时和 90 天时的死亡情况。

样品采集

将在入住 ICU 后的前 24 小时内（第 0 天）、然后在入住 ICU 后 48 小时（第 2 天）和 7 天（第 7 天）以及此后每周一次直到 ICU 出院，对每位患者进行口咽和直肠拭子检测。 直肠和口咽拭子将由训练有素的医务人员使用无菌拭子和运输介质 ESwab®（美国新泽西州 Becton，Dickinson and Company）进行。 拭子将储存在 -80°C 直至 DNA 提取。

DNA提取

将使用用于直肠拭子的 QIAamp PowerFecal Pro DNA® 试剂盒（Qiagen®, Courtaboeuf, France）和用于口咽拭子的 Extracta DNA Prep® 试剂盒（Quanta Biosciences®, Beverly, USA）进行 DNA 提取。 DNA 将通过 Quantit® dsDNA HighSensitivity Assay Kit (Fisher Scientific) 进行定量。

16S rRNA扩增和测序

细菌 16S rRNA 基因序列的 V3 和 V4 区域将通过聚合酶链式反应 (PCR) 使用通用引物（TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGACACAGCCTACGGGNGGCWGCAG 和 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC）按照 Illumina MiSeq® 系统方案（Illumina®）进行扩增。 扩增子将被纯化，然后使用 MiSeq® 测序系统（（Illumina®）进行测序。

序列处理

序列处理和操作分类单元 (OTU) 聚类将使用基于巴斯德研究所提供的 R® 软件（DESeq2 包）的 SHAMAN 软件（SHiny Application for Metagenomic ANalysis）进行。 分类学分类将使用 SILVA 数据库参考进行。

统计分析

将使用 SHAMAN 软件（SHiny Application for Metagenomic ANalysis）进行统计分析。 将分析细菌门、科和属的重新划分，并比较不同种群之间细菌属的相对丰度。 将使用不同的参数（香农指数、辛普森多样性指数）以及贝塔多样性（主成分分析）来分析阿尔法多样性。

将比较不同人群的患者和健康志愿者，并研究微生物群随时间的演变。