骨骼肌线粒体异常和肺动脉高压的代谢综合征

目标 1：

确定 MS 是否与人 PAH 中的肌肉内脂质积累以及骨骼肌代谢和灌注受损有关。

理由：即使没有肥胖和糖尿病，MS 和 IR 在 PAH 患者中也非常普遍。 文献中有几行证据表明，IR 随着胰岛素反应组织内脂肪酸代谢物的积累而发展，尤其是骨骼肌内的肌细胞内脂质沉积。 虽然导致脂质积累的机制仍然难以捉摸，但已经提出线粒体密度降低导致脂质氧化减少。 目标 1 的目标是 1) 确认 PAH 患者肌肉内脂质积累增加； 2) 确定肌内脂质积累是否与骨骼肌代谢受损有关； 3) 证明这些异常与 PAH 患者的 MS 和 IR 以及骨骼肌功能相关。

实验方法：拟议的实验将在 PAH 患者 (n=10-20) 与 10 名年龄、性别、身高和体重（基于当前建议的定义）相匹配的健康但久坐的受试者身上进行，不包括具有临床相关条件的患者（例如 糖尿病）。 这些人在右心导管插入术 (CER#20735) 时通过我们的系统血浆生物库过程不断被识别，其中大约 40% 没有肥胖/糖尿病的 PAH 患者患有 MS。 除了常规执行的分析之外：A) 将抽取血样用于载脂蛋白 A1、载脂蛋白 B、糖化血红蛋白、空腹血糖、胰岛素、脂联素和瘦素。 B) MR 成像将用于评估股四头肌、肝脏和心脏内的脂肪浸润（详见附录）。 C) 如前所述，将评估自行车测力计上主要股四头肌和 VO2peak 的意志和非意志力量和耐力。 D) 将采集非优势腿股外侧肌的经皮活检标本。 部分标本 (≈100mg) 将用于免疫组织化学纤维分型（乙醇改良技术）、毛细管化（使用 CD31 抗体的定量 IF）和细胞内脂质积累（油红 O 染色，仅染色最疏水和中性的脂质，正如调查人员先前所描述的那样。 细胞外通量分析仪 Seahorse XF24 将用于剩余组织，以实时测量耗氧量和细胞外酸化率（糖酵解）。 为确保缺乏身体活动不会导致骨骼肌脂质积累，将使用身体活动监测器（SenseWear® 臂带）在一周内客观量化受试者的日常生活身体活动。

解释：这种多模式方法将提供全面的信息来确认：1) 与对照组相比，PAH 患者的股四头肌脂质积累显着增加； 2) 与没有 MS 的 PAH 相比，尽管身体活动水平相似，但患有 MS 的 PAH 患者骨骼肌内的脂质积累增加； 3) 脂质积累与体内脂质氧化的减少有关； 4) MS/IR 和股四头肌功能与肌肉脂质积累/葡萄糖氧化磷酸化能力相关。

样本量和分析：在确认正态性/等方差（Levene 检验）后，将使用单向方差分析进行组间比较，然后进行 Tukey-Kramer 后检验。 10 名受试者/组将允许检测到通过 MRI（主要结果）评估的股四头肌脂质积累增加 1.5±0.5 倍，其中 1 类和 2 类错误分别为 5% 和 15%。 根据我们的初步数据（图 3C），这些估计是保守的。

替代方法：肝脏中的胰岛素作用与肌肉中的胰岛素作用有许多相似之处。 虽然我们的建议侧重于骨骼肌，但肝脏中的异位脂质积累也越来越多地被认为是导致 MS 和 IR 的原因。 由于评估脂肪浸润的 MRI 序列只需要几分钟，肝脏和腹部肥胖将在同一次检查 MR 研究中进行评估，如前所述。

目标 2：

评估 IR 和 MS 是否与 PAH 骨骼肌内的胰岛素信号传导缺陷有关。

理由：大量研究证实，2 型糖尿病患者肌肉中过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPAR) γ 辅激活因子 1α 的表达减少，从而减少促进二酰甘油在肌肉内积累的线粒体脂肪酸氧化。 在骨骼肌中，胰岛素与其受体结合，激活受体酪氨酸激酶活性，随后磷酸化和激活胰岛素受体底物 1 (IRS1)，最终促进含葡萄糖转运蛋白 (GLUT4) 的囊泡与血浆的对接和融合膜。 细胞内甘油二酯的积累已被证明可以特异性激活蛋白激酶 C (PKC) θ，从而减少 IRS1 的酪氨酸磷酸化。 一致地，在患有 2 型糖尿病和 IR 的个体的肌肉中已经注意到肌肉 PKCθ 的激活和 IRS1 的丝氨酸（失活）磷酸化增加。 最近，核呼吸因子 2 (NRF2)-Keap1 通路的激活（改善线粒体耗氧量、ATP 产生和脂肪酸的 β 氧化）已被证明可以减少葡萄糖摄取和 IR。

实验方法：将使用与目标 1 中描述的相同的实验组和实验设计。 A) 为了检查导致 PAH 骨骼肌中线粒体活性降低的机制，将检查已知调节线粒体生物发生的几个关键转录因子和共调节因子的表达，包括 PPARγ 辅激活因子 1α (PGC-1α)， NRF-2 和线粒体转录因子 A（WB 和免疫沉淀测定）。 还将评估线粒体氧化（柠檬酸合酶、己糖激酶）和糖酵解（乳酸脱氢酶、磷酸果糖激酶）酶活性（分光光度技术）。 B) 为了评估 IRS-1 丝氨酸磷酸化在 IR 发病机制中的潜在作用，研究人员还将检查几个丝氨酸残基（Ser307、Ser312、Ser616、Ser636）上的 IRS-1 丝氨酸磷酸化，这些残基与干扰有关与体外胰岛素信号传导 (WB)。 PKCθ 表达和活性将使用亚型特异性 PKC 抗体 (WB) 和 PKC 酶测定试剂盒进行评估。

解释：研究人员希望证明：1) PAH 患者表现出 PPARγ1α 和 NRF-2 的表达/激活减少，IRS-1 在关键丝氨酸位点和 PKCθ 激活的磷酸化增加，导致代谢向糖酵解转变； 2) 与没有 MS 的 PAH 相比，这些异常在 PAH-MS 患者中占主导地位。

替代方法：PKCθ 激活主要与 MS 相关。 然而，可以对 PKC 基因家族的其他成员进行相同的实验。 如果上述“经典 MS 途径”不能解释 PAH 中的 IR/MS，那么最近在 IR/MS 和 PAH 中涉及的骨骼肌解偶联蛋白 2 和 Sirtuin-3 的作用将是探索。