Mitochondriální abnormality kosterního svalstva a metabolický syndrom u PAH

CÍL 1:

Stanovit, zda je RS spojena s intramuskulární akumulací lipidů a narušeným metabolismem a perfuzí kosterního svalstva u lidské PAH.

Odůvodnění: RS a IR jsou vysoce převládající mezi pacienty s PAH i bez obezity a diabetu. V literatuře existuje několik linií důkazů, že IR se vyvíjí s akumulací metabolitů mastných kyselin ve tkáních reagujících na inzulín, zejména intramyocelulárním ukládáním lipidů v kosterních svalech. Ačkoli mechanismus odpovědný za akumulaci lipidů zůstává nepolapitelný, bylo navrženo snížení oxidace lipidů v důsledku snížení mitochondriální hustoty. Cíle Cíle 1 jsou 1) potvrdit, že pacienti s PAH mají zvýšenou intramuskulární akumulaci lipidů; 2) určit, zda je intramuskulární akumulace lipidů spojena s narušeným metabolismem kosterního svalstva; 3) prokázat, že tyto abnormality korelují s RS a IR a funkcí kosterního svalstva u pacientů s PAH.

Experimentální přístupy: Navržené experimenty budou provedeny na pacientech s PAH (n=10-20) vs. 10 zdravých, ale sedavých subjektů odpovídajících věku, pohlaví, výšce a hmotnosti (definice na základě současných doporučení), s výjimkou pacientů s klinicky relevantními stavy ( např. diabetes). Tito jedinci jsou průběžně identifikováni prostřednictvím našeho systematického procesu biobankingu plazmy v době katetrizace pravého srdce (CER#20735), kdy zhruba 40 % pacientů s PAH bez obezity/diabetu má RS. Kromě rutinně prováděných rozborů: A) bude odebrán vzorek krve na apolipoprotein A1, apolipoprotein B, glykovaný hemoglobin, glykémii nalačno, inzulín, adiponektin a leptin. B) MR zobrazení bude použito k posouzení tukové infiltrace do čtyřhlavého svalu, jater a srdce (podrobnosti viz příloha). C) Bude hodnocena dobrovolná a nedobrovolná síla a vytrvalost dominantního kvadricepsu a vrchol VO2 na cykloergometru, jak bylo popsáno výše. D) Budou odebrány vzorky z perkutánní biopsie m. vastus lateralis nedominantní nohy. Část vzorku (≈100 mg) bude použita pro imunohistochemickou typizaci vláken (technika modifikovaná etanolem), kapilarizaci (kvantitativní IF s použitím protilátky CD31) a intramyocelulární akumulaci lipidů (barvení Oil red O, které barví pouze nejvíce hydrofobní a neutrální lipidy, jak již dříve popsali vyšetřovatelé. Analyzátor extracelulárního toku Seahorse XF24 bude použit na zbývajících tkáních pro měření spotřeby kyslíku v reálném čase a rychlosti extracelulární acidifikace (glykolýza). Aby bylo zajištěno, že fyzická nečinnost není zodpovědná za akumulaci lipidů v kosterním svalstvu, budou každodenní fyzické aktivity subjektů objektivně kvantifikovány během jednoho týdne pomocí monitoru fyzické aktivity (náramek SenseWear®).

Interpretace: Tento multimodální přístup poskytne komplexní informace pro potvrzení: 1) Pacienti s PAH vykazují významné zvýšení akumulace lipidů ve svalu čtyřhlavého svalu ve srovnání s kontrolami; 2) akumulace lipidů je zvýšená v kosterním svalstvu pacientů s PAH s RS ve srovnání s PAH bez RS navzdory podobným úrovním fyzické aktivity; 3) Akumulace lipidů je spojena se snížením oxidace lipidů in vivo; 4) MS/IR a funkce čtyřhlavého svalu korelují s akumulací svalových lipidů/kapacitou oxidativní fosforylace glukózy.

Velikost vzorku a analýza: Srovnání mezi skupinami bude provedeno pomocí jednocestné ANOVA následované Tukey-Kramerovým post-testem po potvrzení normality/stejných rozptylů (Leveneův test). 10 subjektů/skupina umožní detekci 1,5±0,5násobného zvýšení akumulace lipidů ve svalu čtyřhlavého svalu hodnoceného pomocí MRI (primární výsledek) s chybami typu 1 a 2 5 % a 15 %. Na základě našich předběžných údajů (obr. 3C) jsou tyto odhady konzervativní.

Alternativní přístup: Působení inzulínu v játrech má mnoho podobností s působením inzulínu ve svalech. Ačkoli se náš návrh zaměřuje na kosterní svaly, ektopická akumulace lipidů v játrech je také stále více uznávána jako přispívající k RS a IR. Vzhledem k tomu, že sekvence MRI k posouzení tukové infiltrace zabere pouze několik minut, jaterní a abdominální adipozita bude hodnocena během stejné vyšetřovací MR studie, jak bylo popsáno dříve.

CÍL 2:

Posoudit, zda IR a MS souvisí s defekty inzulinové signalizace v kosterních svalech PAH.

Odůvodnění: Četné studie potvrdily snížení exprese peroxisomového proliferátorem aktivovaného receptoru (PPAR) γ koaktivátoru 1α ve svalech pacientů s diabetes mellitus 2. typu, což snižuje mitochondriální oxidaci mastných kyselin, která podporuje akumulaci diacylglycerolu ve svalu. V kosterních svalech se inzulin váže na svůj receptor, aktivuje aktivitu receptorové tyrozinkinázy s následnou fosforylací a aktivací substrátu inzulinového receptoru 1 (IRS1), což nakonec podporuje připojení a fúzi vezikulů obsahujících přenašeč glukózy (GLUT4) do plazmy. membrána. Bylo prokázáno, že akumulace intracelulárního diacylglycerolu specificky aktivuje proteinkinázy C (PKC) θ, což vede ke snížení fosforylace tyrosinu IRS1. V souladu s tím byla ve svalech jedinců s diabetes mellitus 2. typu a IR zaznamenána aktivace svalové PKC9 a zvýšená serinová (inaktivační) fosforylace IRS1. Nedávno bylo prokázáno, že aktivace dráhy nukleárního respiračního faktoru-2 (NRF2)-Keap1 (zlepšení spotřeby mitochondriálního kyslíku, produkce ATP a beta-oxidace mastných kyselin) snižuje vychytávání glukózy a IR.

Experimentální přístupy: Budou použity stejné experimentální skupiny a experimentální design, jak je popsáno v cíli 1. A) Za účelem prozkoumání mechanismů odpovědných za snížení mitochondriální aktivity v kosterních svalech PAH bude zkoumána exprese několika klíčových transkripčních faktorů a koregulátorů, o kterých je známo, že regulují mitochondriální biogenezi, včetně PPARγ koaktivátoru 1α (PGC-1α), NRF-2 a mitochondriální transkripční faktor A (WB a imunoprecipitační test). Dále bude hodnocena aktivita mitochondriálních oxidativních (citrátsyntáza, hexokináza) a glykolytických (laktátdehydrogenáza, fosfofruktokináza) enzymů (spektrofotometrické techniky). B) Aby bylo možné posoudit potenciální roli fosforylace serinu IRS-1 v patogenezi IR, vyšetřovatelé také prozkoumají fosforylaci serinu IRS-1 na několika serinových zbytcích (Ser307, Ser312, Ser616, Ser636), u kterých se předpokládá, že interferují s inzulinovou signalizací in vitro (WB). Exprese a aktivita PKC9 budou hodnoceny pomocí izoformně specifických PKC protilátek (WB) a soupravy pro enzymový test PKC.

Interpretace: Výzkumníci očekávají, že prokážou, že: 1) pacienti s PAH vykazují sníženou expresi/aktivaci PPARy1α a NRF-2, zvýšenou fosforylaci IRS-1 na kritických serinových místech a aktivaci PKC9, což vede k metabolickému posunu směrem ke glykolýze; 2) tyto abnormality dominují mezi pacienty s PAH-MS ve srovnání s PAH bez MS.

Alternativní přístup: Aktivace PKCθ byla spojena převážně s RS. Stejné experimenty by však mohly být provedeny pro další členy genové rodiny PKC. V případě, že „klasické dráhy RS“ popsané výše nezohledňují IR/MS u PAH, bude role kosterního svalu Uncoupling Protein-2 a Sirtuin-3, které se nedávno účastní jak IR/MS, tak PAH, prozkoumány.