Anormalidades Mitocondriais do Músculo Esquelético e a Síndrome Metabólica na HAP

OBJETIVO 1:

Determinar se a EM está associada ao acúmulo de lipídios intramusculares e ao comprometimento do metabolismo e perfusão do músculo esquelético na HAP humana.

Justificativa: EM e RI são altamente prevalentes entre os pacientes com HAP, mesmo na ausência de obesidade e diabetes. Existem várias linhas de evidência na literatura de que a RI se desenvolve com o acúmulo de metabólitos de ácidos graxos nos tecidos responsivos à insulina, especialmente a deposição de lipídios intramiocelulares nos músculos esqueléticos. Embora o mecanismo responsável pelo acúmulo de lipídios permaneça indefinido, foi proposta uma redução na oxidação lipídica como resultado da redução na densidade mitocondrial. Os objetivos do Objetivo 1 são 1) confirmar que os pacientes com HAP apresentam acúmulo aumentado de lipídios intramusculares; 2) determinar se o acúmulo intramuscular de lipídios está associado ao comprometimento do metabolismo do músculo esquelético; 3) para demonstrar que essas anormalidades se correlacionam com SM e RI e função muscular esquelética entre pacientes com HAP.

Abordagens experimentais: Os experimentos propostos serão realizados em pacientes com HAP (n=10-20) versus 10 indivíduos saudáveis, mas sedentários, pareados por idade, sexo, altura e peso (definição baseada nas recomendações atuais), excluindo pacientes com condições clinicamente relevantes ( por exemplo. diabetes). Esses indivíduos são continuamente identificados por meio de nosso processo sistemático de biobanco de plasma no momento do cateterismo cardíaco direito (CER#20735), no qual cerca de 40% dos pacientes com HAP sem obesidade/diabetes têm EM. Além das análises rotineiras: A) será coletada amostra de sangue para Apolipoproteína A1, Apolipoproteína B, hemoglobina glicada, glicemia de jejum, insulina, adiponectina e leptina. B) A ressonância magnética será usada para avaliar a infiltração de gordura no músculo quadríceps, fígado e coração (consulte o apêndice para obter detalhes). C) Serão avaliadas a força e resistência volitiva e não volitiva do quadríceps dominante e VO2pico em cicloergômetro, conforme descrito anteriormente. D) Serão colhidas amostras de biópsia percutânea do músculo vasto lateral da perna não dominante. Parte da amostra (≈100mg) será utilizada para tipagem imunohistoquímica de fibras (técnica modificada com etanol), capilarização (IF quantitativo usando anticorpo CD31) e acúmulo de lipídeos intramiocelulares (coloração Oil red O, que cora apenas os lipídios mais hidrofóbicos e neutros, como os investigadores descreveram anteriormente. O analisador de fluxo extracelular Seahorse XF24 será utilizado nos tecidos remanescentes para medições em tempo real do consumo de oxigênio e taxas de acidificação extracelular (glicólise). Para garantir que a inatividade física não seja responsável pelo acúmulo de lipídios no músculo esquelético, as atividades físicas da vida diária dos indivíduos serão quantificadas objetivamente durante uma semana usando um monitor de atividade física (braçadeira SenseWear®).

Interpretação: Esta abordagem multimodal fornecerá informações abrangentes para confirmar: 1) os pacientes com HAP exibem aumentos significativos no acúmulo de lipídios no músculo quadríceps em comparação com os controles; 2) o acúmulo de lipídios aumenta no músculo esquelético de pacientes com HAP com EM em comparação com HAP sem EM, apesar dos níveis semelhantes de atividade física; 3) O acúmulo de lipídeos está associado à redução da oxidação lipídica in vivo; 4) MS/IR e função do músculo quadríceps correlacionam-se com o acúmulo de lipídeos no músculo/capacidade de fosforilação oxidativa da glicose.

Tamanho da amostra e análise: As comparações entre os grupos serão realizadas por ANOVA one-way seguida de pós-teste de Tukey-Kramer, após confirmação da normalidade/variâncias iguais (teste de Levene). 10 indivíduos/grupo permitirão detectar um aumento de 1,5±0,5 vezes no acúmulo de lipídios no músculo quadríceps avaliado por ressonância magnética (resultado primário) com erros tipo 1 e 2 de 5% e 15%. Com base em nossos dados preliminares (Fig.3C), essas estimativas são conservadoras.

Abordagem alternativa: A ação da insulina no fígado tem muitas semelhanças com a ação da insulina no músculo. Embora nossa proposta se concentre nos músculos esqueléticos, o acúmulo ectópico de lipídios no fígado também é cada vez mais reconhecido como contribuindo para a SM e a RI. Como as sequências de ressonância magnética para avaliar a infiltração de gordura levam apenas alguns minutos, a adiposidade hepática e abdominal serão avaliadas durante o mesmo exame de estudo de RM, conforme descrito anteriormente.

OBJETIVO 2:

Avaliar se a RI e a EM estão relacionadas a defeitos na sinalização da insulina nos músculos esqueléticos da HAP.

Justificativa: Numerosos estudos confirmaram uma redução na expressão do receptor ativado por proliferador de peroxissoma (PPAR) γ coativador 1α nos músculos de pacientes com diabetes mellitus tipo 2, reduzindo a oxidação mitocondrial de ácidos graxos que promove o acúmulo de diacilglicerol dentro do músculo. Nos músculos esqueléticos, a insulina se liga ao seu receptor, ativando a atividade da tirosina quinase do receptor, com subsequente fosforilação e ativação do substrato do receptor de insulina 1 (IRS1), promovendo finalmente o acoplamento e a fusão das vesículas contendo o transportador de glicose (GLUT4) ao plasma membrana. Foi demonstrado que o acúmulo de diacilglicerol intracelular ativa especificamente a proteína quinase C (PKC) θ, resultando na redução da fosforilação da tirosina do IRS1. Consistentemente, a ativação da PKCθ muscular e o aumento da fosforilação da serina (inativação) do IRS1 foram observados nos músculos de indivíduos com diabetes mellitus tipo 2 e RI. Mais recentemente, a ativação da via do fator respiratório nuclear-2 (NRF2)-Keap1 (melhorando o consumo de oxigênio mitocondrial, a produção de ATP e a beta-oxidação de ácidos graxos) demonstrou reduzir a captação de glicose e a RI.

Abordagens experimentais: Serão utilizados os mesmos grupos experimentais e delineamento experimental descritos no objetivo 1. A) A fim de examinar os mecanismos responsáveis ​​pela redução da atividade mitocondrial nos músculos esqueléticos da HAP, será examinada a expressão de vários fatores chave de transcrição e co-reguladores que são conhecidos por regular a biogênese mitocondrial, incluindo o coativador PPARγ 1α (PGC-1α), NRF-2 e fator A de transcrição mitocondrial (WB e ensaio de imunoprecipitação). Também será avaliada a atividade das enzimas mitocondriais oxidativas (citrato sintase, hexoquinase) e glicolíticas (lactato desidrogenase, fosfofrutoquinase) (técnicas espectrofotométricas). B) A fim de avaliar o papel potencial da fosforilação da serina IRS-1 na patogênese da IR, os investigadores também examinarão a fosforilação da serina IRS-1 em vários resíduos de serina (Ser307, Ser312, Ser616, Ser636) que foram implicados para interferir com sinalização de insulina in vitro (WB). A expressão e atividade de PKCθ serão avaliadas usando anticorpos PKC específicos de isoforma (WB) e um kit de ensaio de enzima PKC.

Interpretação: Os investigadores esperam demonstrar que: 1) pacientes com HAP exibem expressão/ativação reduzida de PPARγ1α e NRF-2, fosforilação aumentada de IRS-1 em locais críticos de serina e ativação de PKCθ, levando a um desvio metabólico em direção à glicólise; 2) essas anormalidades dominam entre os pacientes com HAP-EM em comparação com HAP sem EM.

Abordagem alternativa: A ativação de PKCθ tem sido predominantemente associada à EM. No entanto, os mesmos experimentos podem ser feitos para outros membros da família de genes PKC. Caso as "vias clássicas da EM" descritas acima não sejam responsáveis ​​pela IR/MS na HAP, o papel da proteína de desacoplamento do músculo esquelético-2 e da sirtuína-3, que foram recentemente implicadas tanto na IR/MS quanto na HAP, será explorado.