PAH의 골격근 미토콘드리아 이상과 대사증후군

목표 1:

MS가 인간 PAH에서 근육내 지질 축적 및 손상된 골격근 대사 및 관류와 관련이 있는지 확인합니다.

근거: MS와 IR은 비만과 당뇨병이 없는 경우에도 PAH 환자들 사이에서 매우 널리 퍼져 있습니다. 문헌에는 IR이 인슐린 반응 조직 내 지방산 대사 산물의 축적, 특히 골격근 내 근세포 내 지질 침착과 함께 발생한다는 몇 가지 증거가 있습니다. 지질 축적을 설명하는 메커니즘은 애매하지만, 미토콘드리아 밀도의 감소로 인한 지질 산화의 감소가 제안되었습니다. 목표 1의 목적은 1) PAH 환자가 근육 내 지질 축적이 증가했는지 확인하는 것입니다. 2) 근육내 지질 축적이 손상된 골격근 대사와 연관되는지 여부를 결정하기 위해; 3) 이러한 이상이 PAH 환자의 MS 및 IR 및 골격근 기능과 관련이 있음을 입증합니다.

실험적 접근: 제안된 실험은 PAH 환자(n=10-20)와 나이, 성별, 키 및 체중(현재 권장 사항에 따른 정의)이 일치하는 10명의 건강하지만 활동적이지 않은 피험자에 대해 수행되며 임상적으로 관련된 조건이 있는 환자는 제외됩니다. 예를 들어 당뇨병). 이러한 개인은 비만/당뇨가 없는 PAH 환자의 약 40%가 다발성경화증을 앓고 있는 우심장 카테터 삽입(CER#20735) 시 체계적인 혈장 바이오뱅킹 프로세스를 통해 지속적으로 식별됩니다. 일상적으로 수행되는 분석 외에도: A) 아포지단백 A1, 아포지단백 B, 당화혈색소, ​​공복 혈당, 인슐린, 아디포넥틴 및 렙틴에 대해 혈액 샘플을 채취합니다. B) MR 영상은 대퇴사두근, 간 및 심장 내 지방 침윤을 평가하는 데 사용됩니다(자세한 내용은 부록 참조). C) 이전에 설명한 바와 같이 주기 에르고미터에서 우세한 대퇴사두근과 VO2peak의 의지적 및 비자의적 강도와 지구력을 평가합니다. D) 비우세 다리의 외측광근의 경피적 생검 표본을 채취합니다. 표본의 일부(≈100mg)는 면역조직화학 섬유 유형화(에탄올 수정 기술), 모세관화(CD31-항체를 사용한 정량적 IF) 및 근세포내 지질 축적(가장 소수성 및 중성 지질만 염색하는 오일 레드 O 염색)에 사용됩니다. 조사관이 이전에 설명한 것처럼. 세포외 플럭스 분석기 Seahorse XF24는 나머지 조직에서 산소 소비 및 세포외 산성화 속도(당분해)를 실시간으로 측정하는 데 사용됩니다. 신체 활동 부족이 골격근 지질 축적의 원인이 되지 않도록 하기 위해 신체 활동 모니터(SenseWear® 암밴드)를 사용하여 피험자의 일상 생활 신체 활동을 1주일 동안 객관적으로 정량화합니다.

해석: 이 다중 방식 접근 방식은 다음을 확인하기 위한 포괄적인 정보를 제공합니다. 2) 비슷한 수준의 신체 활동에도 불구하고 MS가 없는 PAH에 비해 MS가 있는 PAH 환자의 골격근 내에서 지질 축적이 증가합니다. 3) 지질 축적은 생체 내 지질 산화의 감소와 관련이 있습니다. 4) MS/IR 및 대퇴사두근 기능은 근육 지질 축적/포도당 산화적 인산화 능력과 상관관계가 있습니다.

샘플 크기 및 분석: 정규성/등분산(Levene's test)을 확인한 후 Tukey-Kramer 사후 테스트가 뒤따르는 일원 분산 분석을 사용하여 그룹 간 비교를 수행합니다. 10명의 피험자/그룹은 5% 및 15%의 유형 1 및 2 오류로 MRI(일차 결과)로 평가된 대퇴사두근 지질 축적의 1.5±0.5배 증가를 감지할 수 있습니다. 우리의 예비 데이터(그림 3C)를 기반으로 이러한 추정치는 보수적입니다.

대체 접근법: 간에서의 인슐린 작용은 근육에서의 인슐린 작용과 많은 유사점이 있습니다. 우리의 제안은 골격근에 초점을 맞추고 있지만 간에서의 이소성 지질 축적도 MS와 IR에 기여하는 것으로 점차 인식되고 있습니다. 지방 침윤을 평가하기 위한 MRI 시퀀스는 몇 분 밖에 걸리지 않기 때문에 이전에 설명한 것처럼 동일한 검사 MR 연구 중에 간 및 복부 지방이 평가됩니다.

목표 2:

IR 및 MS가 PAH 골격근 내의 인슐린 신호 전달 결함과 관련이 있는지 평가합니다.

근거: 수많은 연구에서 제2형 당뇨병 환자의 근육에서 PPAR(peroxisome proliferator-activated receptor) γ coactivator 1α의 발현 감소가 근육 내 디아실글리세롤의 축적을 촉진하는 미토콘드리아 지방산 산화를 감소시키는 것으로 확인되었습니다. 골격근에서 인슐린은 수용체에 결합하여 수용체 티로신 키나아제 활성을 활성화하고, 이어서 인슐린 수용체 기질 1(IRS1)의 인산화 및 활성화를 통해 궁극적으로 글루코스 수송체(GLUT4) 함유 소포의 혈장에 대한 도킹 및 융합을 촉진합니다. 막. 세포내 디아실글리세롤의 축적은 단백질 키나아제 C(PKC)θ를 특이적으로 활성화시켜 IRS1의 티로신 인산화를 감소시키는 것으로 나타났습니다. 일관되게, 근육 PKCθ의 활성화와 IRS1의 증가된 세린(비활성화) 인산화가 제2형 진성 당뇨병 및 IR을 가진 개인의 근육에서 주목되었습니다. 보다 최근에는 핵 호흡 인자-2(NRF2)-Keap1 경로(미토콘드리아 산소 소비, ATP 생성 및 지방산의 베타 산화 개선)의 활성화가 포도당 흡수 및 IR을 감소시키는 것으로 나타났습니다.

실험적 접근: 목표 1에서 설명한 것과 동일한 실험 그룹 및 실험 설계가 사용됩니다. A) PAH 골격근에서 미토콘드리아 활성 감소의 원인이 되는 기전을 조사하기 위해 PPARγ coactivator 1α(PGC-1α), NRF-2 및 미토콘드리아 전사 인자 A(WB 및 면역 침전 분석). 미토콘드리아 산화(구연산 합성효소, 헥소키나아제) 및 당분해(젖산 탈수소효소, 포스포프룩토키나아제) 효소 활성(분광광도법)도 평가합니다. B) IR의 발병기전에서 IRS-1 세린 인산화의 잠재적인 역할을 평가하기 위해, 조사자들은 또한 간섭에 연루된 여러 세린 잔기(Ser307, Ser312, Ser616, Ser636)에 대한 IRS-1 세린 인산화를 조사할 것입니다. 체외(WB)에서 인슐린 신호 전달과 함께. PKCθ 발현 및 활성은 동형-특이적 PKC 항체(WB) 및 PKC 효소 분석 키트를 사용하여 평가될 것이다.

해석: 연구자들은 다음을 입증할 것으로 기대합니다. 1) PAH 환자는 PPARγ1α 및 NRF-2의 발현/활성 감소, 중요한 세린 부위에서 IRS-1의 인산화 증가 및 PKCθ 활성화를 나타내어 해당 작용으로의 대사 전환을 유도합니다. 2) 이러한 이상은 MS가 없는 PAH와 비교하여 PAH-MS 환자 사이에서 우세합니다.

대체 접근법: PKCθ 활성화는 주로 MS와 연관되어 있습니다. 그러나 PKC 유전자 패밀리의 다른 구성원에 대해서도 동일한 실험을 수행할 수 있습니다. 위에서 설명한 "고전적인 MS 경로"가 PAH에서 IR/MS를 설명하지 않는 경우, 최근 IR/MS 및 PAH 모두에 연루된 골격근 Uncoupling Protein-2 및 Sirtuin-3의 역할은 다음과 같습니다. 탐험했다.