Митохондриальные аномалии скелетных мышц и метаболический синдром при ЛАГ

ЦЕЛЬ 1:

Определить, связан ли рассеянный склероз с внутримышечным накоплением липидов и нарушением метаболизма и перфузии скелетных мышц при ЛАГ человека.

Обоснование: РС и ИР широко распространены среди пациентов с ЛАГ даже при отсутствии ожирения и диабета. В литературе имеется несколько доказательств того, что ИР развивается при накоплении метаболитов жирных кислот в чувствительных к инсулину тканях, особенно при интрамиоцеллюлярном отложении липидов в скелетных мышцах. Хотя механизм, ответственный за накопление липидов, остается неясным, было предложено снижение окисления липидов в результате снижения плотности митохондрий. Задачи цели 1: 1) подтвердить, что у пациентов с ЛАГ повышено внутримышечное накопление липидов; 2) определить, связано ли внутримышечное накопление липидов с нарушением метаболизма скелетных мышц; 3), чтобы продемонстрировать, что эти аномалии коррелируют с МС и ИР, а также с функцией скелетных мышц у пациентов с ЛАГ.

Экспериментальные подходы. Предлагаемые эксперименты будут проводиться на пациентах с ЛАГ (n=10–20) и 10 здоровых, но ведущих малоподвижный образ жизни субъектах, сопоставимых по возрасту, полу, росту и весу (определение основано на текущих рекомендациях), за исключением пациентов с клинически значимыми состояниями ( например сахарный диабет). Эти люди постоянно идентифицируются с помощью нашего систематического процесса биобанкирования плазмы во время катетеризации правых отделов сердца (CER # 20735), при котором примерно 40% пациентов с ЛАГ без ожирения / диабета имеют РС. В дополнение к обычно проводимым анализам: A) образец крови будет взят на аполипопротеин A1, аполипопротеин B, гликированный гемоглобин, глюкозу крови натощак, инсулин, адипонектин и лептин. B) МРТ будет использоваться для оценки жировой инфильтрации в четырехглавой мышце, печени и сердце (подробности см. в приложении). C) Будет оцениваться волевая и непроизвольная сила и выносливость доминирующих четырехглавых мышц и VO2peak на велоэргометре, как описано ранее. D) Будут взяты образцы чрескожной биопсии латеральной широкой мышцы недоминантной ноги. Часть образца (≈100 мг) будет использована для иммуногистохимического типирования волокон (метод модификации этанолом), капилляризации (количественный IF с использованием CD31-антител) и накопления внутримиоцеллюлярных липидов (окрашивание масляным красным O, которое окрашивает только наиболее гидрофобные и нейтральные липиды, как ранее описывали следователи. Анализатор внеклеточного потока Seahorse XF24 будет использоваться на оставшихся тканях для измерения потребления кислорода и скорости внеклеточного подкисления (гликолиза) в режиме реального времени. Чтобы гарантировать, что отсутствие физической активности не является причиной накопления липидов в скелетных мышцах, повседневная физическая активность субъектов будет объективно количественно оцениваться в течение одной недели с использованием монитора физической активности (наручная повязка SenseWear®).

Интерпретация: Этот мультимодальный подход предоставит исчерпывающую информацию для подтверждения: 1) у пациентов с ЛАГ наблюдается значительное увеличение накопления липидов в четырехглавой мышце по сравнению с контрольной группой; 2) накопление липидов повышено в скелетных мышцах больных ЛАГ с МС по сравнению с ЛАГ без МС, несмотря на одинаковый уровень физической активности; 3) накопление липидов связано со снижением окисления липидов in vivo; 4) МС/ИР и функция четырехглавой мышцы коррелируют с накоплением липидов в мышцах/способностью к окислительному фосфорилированию глюкозы.

Размер выборки и анализ. Сравнения между группами будут выполняться с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим пост-тестом Тьюки-Крамера после подтверждения нормальности/равных дисперсий (критерий Левена). 10 испытуемых/группа позволят выявить 1,5±0,5-кратное увеличение накопления липидов в четырехглавой мышце по данным МРТ (первичный результат) с ошибками 1 и 2 типа 5% и 15%. Основываясь на наших предварительных данных (рис. 3С), эти оценки являются консервативными.

Альтернативный подход: действие инсулина в печени имеет много общего с действием инсулина в мышцах. Хотя наше предложение сосредоточено на скелетных мышцах, эктопическое накопление липидов в печени также все чаще признается как фактор, способствующий РС и ИР. Поскольку последовательности МРТ для оценки жировой инфильтрации занимают всего несколько минут, ожирение печени и брюшной полости будет оцениваться во время того же МР-исследования, как описано ранее.

ЦЕЛЬ 2:

Оценить, связаны ли ИР и МС с дефектами передачи сигналов инсулина в скелетных мышцах ЛАГ.

Обоснование: многочисленные исследования подтвердили снижение экспрессии коактиватора γ-рецептора, активирующего пролиферацию пероксисом (PPAR) 1α, в мышцах пациентов с сахарным диабетом 2 типа, уменьшая митохондриальное окисление жирных кислот, которое способствует накоплению диацилглицерина в мышцах. В скелетных мышцах инсулин связывается со своим рецептором, активируя активность тирозинкиназы рецептора с последующим фосфорилированием и активацией инсулин-рецепторного субстрата 1 (IRS1), что в конечном итоге способствует стыковке и слиянию везикул, содержащих переносчик глюкозы (GLUT4), с плазмой. мембрана. Было показано, что накопление внутриклеточного диацилглицерола специфически активирует протеинкиназы C (PKC) θ, что приводит к снижению фосфорилирования тирозина IRS1. Соответственно, активация мышечной PKCθ и повышенное сериновое (инактивация) фосфорилирование IRS1 были отмечены в мышцах людей с сахарным диабетом 2 типа и ИР. Совсем недавно было показано, что активация пути ядерного респираторного фактора-2 (NRF2)-Keap1 (улучшение потребления кислорода митохондриями, производство АТФ и бета-окисление жирных кислот) снижает поглощение глюкозы и ИР.

Экспериментальные подходы: будут использоваться те же экспериментальные группы и экспериментальный план, что и в цели 1. A) Чтобы изучить механизмы, ответственные за снижение митохондриальной активности в скелетных мышцах ФАГ, будет изучена экспрессия нескольких ключевых транскрипционных факторов и корегуляторов, которые, как известно, регулируют митохондриальный биогенез, включая коактиватор PPARγ 1α (PGC-1α), NRF-2 и митохондриальный транскрипционный фактор А (WB и анализ иммунопреципитации). Также будет оцениваться активность митохондриальных окислительных (цитратсинтаза, гексокиназа) и гликолитических (лактатдегидрогеназа, фосфофруктокиназа) ферментов (спектрофотометрические методы). B) Чтобы оценить потенциальную роль фосфорилирования серина IRS-1 в патогенезе ИР, исследователи также изучат фосфорилирование серина IRS-1 по нескольким остаткам серина (Ser307, Ser312, Ser616, Ser636), которые, как предполагалось, причастны к интерференции. с передачей сигналов инсулина in vitro (WB). Экспрессию и активность PKCθ будут оценивать с использованием специфичных к изоформе антител к PKC (WB) и набора для анализа фермента PKC.

Интерпретация: исследователи ожидают продемонстрировать, что: 1) у пациентов с ЛАГ наблюдается снижение экспрессии/активации PPARγ1α и NRF-2, повышенное фосфорилирование IRS-1 в критических участках серина и активация PKCθ, что приводит к метаболическому сдвигу в сторону гликолиза; 2) эти нарушения преобладают среди больных ЛАГ-РС по сравнению с ЛАГ без РС.

Альтернативный подход: активация PKCθ преимущественно связана с рассеянным склерозом. Однако такие же эксперименты можно провести и с другими членами семейства генов PKC. В случае, если «классические пути РС», описанные выше, не учитывают ИР/МС при ЛАГ, роль скелетно-мышечного разобщающего белка-2 и сиртуина-3, которые недавно были вовлечены как в ИР/РС, так и в ЛАГ, будет исследовал.