Skelettmuskel mitokondriella abnormiteter och det metabola syndromet vid PAH

MÅL 1:

Att avgöra om MS är associerat med intramuskulär lipidackumulering och försämrad skelettmuskelmetabolism och perfusion i human PAH.

Motivering: MS och IR är mycket vanliga bland PAH-patienter även i frånvaro av fetma och diabetes. Det finns flera bevis i litteraturen för att IR utvecklas med ackumulering av fettsyrametaboliter i insulinkänsliga vävnader, särskilt intramyocellulär lipiddeposition i skelettmuskler. Även om mekanismen som står för lipidackumulering förblir svårfångad, har en minskning av lipidoxidation som ett resultat av minskning av mitokondriell densitet föreslagits. Målen för mål 1 är 1) att bekräfta att PAH-patienter har ökad intramuskulär lipidackumulering; 2) att bestämma om intramuskulär lipidackumulering är associerad med försämrad skelettmuskelmetabolism; 3) att visa att dessa abnormiteter korrelerar med MS och IR och skelettmuskelfunktion bland PAH-patienter.

Experimentella tillvägagångssätt: De föreslagna experimenten kommer att utföras på PAH-patienter (n=10-20) kontra 10 friska men stillasittande försökspersoner matchade för ålder, kön, längd och vikt (definition baserat på nuvarande rekommendationer), exklusive patienter med kliniskt relevanta tillstånd ( t.ex. diabetes). Dessa individer identifieras kontinuerligt genom vår systematiska plasmabiobankprocess vid tidpunkten för kateterisering av höger hjärta (CER#20735), där ungefär 40 % av PAH-patienter utan fetma/diabetes har MS. Förutom rutinmässiga analyser: A) kommer blodprov tas för Apolipoprotein A1, Apolipoprotein B, glykerat hemoglobin, fasteblodsocker, insulin, adiponektin och leptin. B) MR-avbildning kommer att användas för att bedöma fettinfiltration i quadricepsmuskeln, levern och hjärtat (se bilagan för detaljer). C) Villig och icke viljemässig styrka och uthållighet hos de dominanta quadriceps och VO2peak på cykelergometer kommer att bedömas, som tidigare beskrivits. D) Perkutana biopsiprover av vastus lateralis-muskeln i det icke-dominanta benet kommer att tas. En del av provet (≈100mg) kommer att användas för immunhistokemisk fibertypning (etanolmodifierad teknik), kapillärisering (kvantitativ IF med CD31-antikropp) och intramyocellulär lipidackumulering (Oil red O-färgning, som färgar endast de mest hydrofoba och neutrala lipiderna, som utredarna tidigare beskrivit. Den extracellulära flödesanalysatorn Seahorse XF24 kommer att användas på de återstående vävnaderna för realtidsmätningar av syreförbrukning och extracellulära försurningshastigheter (glykolys). För att säkerställa att fysisk inaktivitet inte är ansvarig för ansamling av fett i skelettmuskulaturen, kommer försökspersoners fysiska aktiviteter i vardagen att kvantifieras objektivt under en vecka med hjälp av en fysisk aktivitetsmonitor (SenseWear® armband).

Tolkning: Denna multimodalitetsmetod kommer att ge omfattande information för att bekräfta: 1) PAH-patienter uppvisar signifikanta ökningar av fettackumulering av quadricepsmuskeln jämfört med kontroller; 2) lipidackumulering ökar i skelettmuskeln hos PAH-patienter med MS jämfört med PAH utan MS trots liknande nivåer av fysisk aktivitet; 3) Lipidackumulering är associerad med en minskning av lipidoxidation in vivo; 4) MS/IR och quadriceps muskelfunktion korrelerar med muskellipidackumulering/glukosoxidativ fosforyleringskapacitet.

Provstorlek och analys: Jämförelser mellan grupper kommer att utföras med envägs ANOVA följt av ett Tukey-Kramer eftertest, efter bekräftelse av normalitet/lika varianser (Levenes test). 10 försökspersoner/grupp kommer att göra det möjligt att detektera en 1,5±0,5-faldig ökning av fettackumulering i quadricepsmuskeln bedömd med MRT (primärt utfall) med typ 1- och 2-fel på 5 % och 15 %. Baserat på våra preliminära data (Fig.3C) är dessa uppskattningar konservativa.

Alternativt tillvägagångssätt: Insulinverkan i levern har många likheter med insulinverkan i muskler. Även om vårt förslag fokuserar på skelettmuskler, är ektopisk lipidackumulering i levern också alltmer erkänd som bidrar till MS och IR. Eftersom MR-sekvenser för att bedöma fettinfiltration endast tar några minuter, kommer lever- och bukfett att bedömas under samma undersökning av MR-studie, som tidigare beskrivits.

MÅL 2:

Att bedöma om IR och MS är relaterade till defekter i insulinsignalering inom PAH skelettmuskler.

Motivering: Flera studier bekräftade en minskning av uttrycket av den peroxisomproliferatoraktiverade receptorn (PPAR) γ-koaktivatorn 1α i musklerna hos patienter med typ 2-diabetes mellitus, vilket minskade den mitokondriella fettsyraoxidationen som främjar ackumuleringen av diacylglycerol i muskeln. I skelettmuskler binder insulin till sin receptor, aktiverar receptortyrosinkinasaktiviteten, med efterföljande fosforylering och aktivering av insulinreceptorsubstrat 1 (IRS1), vilket i slutändan främjar dockningen och sammansmältningen av glukostransportör (GLUT4)-innehållande vesiklar till plasman membran. Ackumulering av intracellulär diacylglycerol har visat sig specifikt aktivera proteinkinaser C (PKC) θ, vilket resulterar i minskning av tyrosinfosforylering av IRS1. Konsekvent har aktivering av muskel PKCθ och ökad serin (inaktivering) fosforylering av IRS1 noterats i musklerna hos individer med typ 2 diabetes mellitus och IR. På senare tid har aktiveringen av den nukleära respiratoriska faktor-2 (NRF2)-Keap1-vägen (förbättring av mitokondriell syreförbrukning, ATP-produktion och beta-oxidation av fettsyror) visat sig minska glukosupptag och IR.

Experimentella tillvägagångssätt: Samma experimentgrupper och experimentell design som beskrivs i mål 1 kommer att användas. A) För att undersöka de mekanismer som är ansvariga för minskningen av mitokondriell aktivitet i PAH skelettmuskler, kommer uttrycket av flera viktiga transkriptionsfaktorer och koregulatorer som är kända för att reglera mitokondriell biogenes att undersökas, inklusive PPARγ coactivator 1α (PGC-1α), NRF-2 och mitokondriell transkriptionsfaktor A (WB och immunoutfällningsanalys). Mitokondriell oxidativ (citratsyntas, hexokinas) och glykolytisk (laktatdehydrogenas, fosfofruktokinas) enzymaktivitet (spektrofotometriska tekniker) kommer också att bedömas. B) För att bedöma den potentiella rollen av IRS-1 serinfosforylering i patogenesen av IR kommer utredarna också att undersöka IRS-1 serinfosforylering på flera serinrester (Ser307, Ser312, Ser616, Ser636) som har varit inblandade att störa med insulinsignalering in vitro (WB). PKCθ-uttryck och aktivitet kommer att bedömas med användning av isoformspecifika PKC-antikroppar (WB) och ett PKC-enzymanalyskit.

Tolkning: Utredarna förväntar sig att visa att: 1) PAH-patienter uppvisar minskat uttryck/aktivering av PPARγ1α och NRF-2, ökad fosforylering av IRS-1 på kritiska serinställen och PKCθ-aktivering, vilket leder till ett metaboliskt skifte mot glykolys; 2) dessa abnormiteter dominerar bland PAH-MS-patienter jämfört med PAH utan MS.

Alternativt tillvägagångssätt: PKCθ-aktivering har huvudsakligen associerats med MS. Samma experiment kunde dock göras för andra medlemmar av PKC-genfamiljen. I händelse av att "klassiska MS-vägar" som beskrivs ovan inte tar hänsyn till IR/MS i PAH, kommer rollen av skelettmuskulaturen att koppla bort Protein-2 och Sirtuin-3, som nyligen har varit inblandade i både IR/MS och PAH, att vara utforskade.