Skjelettmuskel mitokondrielle abnormiteter og metabolsk syndrom ved PAH

MÅL 1:

For å bestemme om MS er assosiert med intramuskulær lipidakkumulering og nedsatt skjelettmuskelmetabolisme og perfusjon i human PAH.

Begrunnelse: MS og IR er svært utbredt blant PAH-pasienter selv i fravær av fedme og diabetes. Det er flere bevis i litteraturen for at IR utvikler seg med akkumulering av fettsyremetabolitter i insulinresponsivt vev, spesielt intramyocellulær lipidavsetning i skjelettmuskulatur. Selv om mekanismen som står for lipidakkumulering fortsatt er unnvikende, har en reduksjon i lipidoksidasjon som et resultat av reduksjon i mitokondriell tetthet blitt foreslått. Målet med mål 1 er 1) å bekrefte at PAH-pasienter har økt intramuskulær lipidakkumulering; 2) å bestemme om intramuskulær lipidakkumulering er assosiert med nedsatt skjelettmuskelmetabolisme; 3) å demonstrere at disse abnormitetene korrelerer med MS og IR og skjelettmuskelfunksjon blant PAH-pasienter.

Eksperimentelle tilnærminger: De foreslåtte eksperimentene vil bli utført på PAH-pasienter (n=10-20) vs. 10 friske, men stillesittende forsøkspersoner matchet for alder, kjønn, høyde og vekt (definisjon basert på gjeldende anbefalinger), unntatt pasienter med klinisk relevante tilstander ( f.eks. diabetes). Disse personene identifiseres kontinuerlig gjennom vår systematiske plasmabiobankprosess på tidspunktet for kateterisering av høyre hjerte (CER#20735), der omtrent 40 % av PAH-pasienter uten fedme/diabetes har MS. I tillegg til rutinemessig utførte analyser: A) vil det bli tatt blodprøve for Apolipoprotein A1, Apolipoprotein B, glykert hemoglobin, fastende blodsukker, insulin, adiponectin og leptin. B) MR-avbildning vil bli brukt for å vurdere fettinfiltrasjon i quadriceps-muskelen, leveren og hjertet (se vedlegg for detaljer). C) Frivillig og frivillig styrke og utholdenhet av dominant quadriceps og VO2peak på sykkelergometer vil bli vurdert, som tidligere beskrevet. D) Perkutane biopsiprøver av vastus lateralis-muskelen i det ikke-dominante benet vil bli tatt. En del av prøven (≈100mg) vil bli brukt til immunhistokjemi fibertyping (etanolmodifisert teknikk), kapillarisering (kvantitativ IF ved bruk av CD31-antistoff) og intramyocellulær lipidakkumulering (Oil red O-farging, som farger bare de mest hydrofobe og nøytrale lipidene, som etterforskerne tidligere har beskrevet. Den ekstracellulære fluksanalysatoren Seahorse XF24 vil bli brukt på gjenværende vev for sanntidsmålinger av oksygenforbruk og ekstracellulære forsuringshastigheter (glykolyse). For å sikre at fysisk inaktivitet ikke er ansvarlig for lipidakkumulering i skjelettmuskulaturen, vil forsøkspersoners fysiske aktiviteter i dagliglivet bli objektivt kvantifisert i løpet av en uke ved hjelp av en fysisk aktivitetsmonitor (SenseWear® armbånd).

Tolkning: Denne multimodalitetstilnærmingen vil gi omfattende informasjon for å bekrefte: 1) PAH-pasienter viser signifikant økning i quadriceps muskellipidakkumulering sammenlignet med kontroller; 2) lipidakkumulering øker i skjelettmuskulaturen til PAH-pasienter med MS sammenlignet med PAH uten MS til tross for lignende nivåer av fysisk aktivitet; 3) Lipidakkumulering er assosiert med en reduksjon i lipidoksidasjon in vivo; 4) MS/IR og quadriceps muskelfunksjon korrelerer med muskellipidakkumulering/glukoseoksidativ fosforyleringskapasitet.

Prøvestørrelse og analyse: Sammenligninger mellom grupper vil bli utført ved bruk av enveis ANOVA etterfulgt av en Tukey-Kramer post-test, etter bekreftelse av normalitet/like varianser (Levenes test). 10 forsøkspersoner/gruppe vil tillate å oppdage en 1,5±0,5 ganger økning i quadriceps muskellipidakkumulering vurdert ved MR (primært utfall) med type 1 og 2 feil på 5 % og 15 %. Basert på våre foreløpige data (Fig.3C), er disse estimatene konservative.

Alternativ tilnærming: Insulinvirkning i leveren har mange likhetstrekk med insulinvirkning i muskler. Selv om forslaget vårt fokuserer på skjelettmuskulatur, er ektopisk lipidakkumulering i leveren også i økende grad anerkjent som å bidra til MS og IR. Siden MR-sekvenser for å vurdere fettinfiltrasjon bare tar noen få minutter, vil lever- og abdominal fett bli vurdert under den samme MR-undersøkelsen, som tidligere beskrevet.

MÅL 2:

For å vurdere om IR og MS er relatert til defekter i insulinsignalering i PAH skjelettmuskulatur.

Begrunnelse: Tallrike studier bekreftet en reduksjon i uttrykket av den peroksisomproliferatoraktiverte reseptoren (PPAR) γ-koaktivator 1α i musklene til pasienter med type 2 diabetes mellitus, noe som reduserer den mitokondrielle fettsyreoksidasjonen som fremmer akkumulering av diacylglycerol i muskelen. I skjelettmuskulaturen binder insulin seg til reseptoren, aktiverer reseptortyrosinkinaseaktiviteten, med påfølgende fosforylering og aktivering av insulinreseptorsubstrat 1 (IRS1), noe som til slutt fremmer dokking og fusjon av glukosetransportør (GLUT4)-holdige vesikler til plasmaet membran. Akkumulering av intracellulær diacylglycerol har vist seg å spesifikt aktivere proteinkinaser C (PKC) θ, noe som resulterer i reduksjon i tyrosinfosforylering av IRS1. Konsekvent har aktivering av muskel PKCθ og økt serin (inaktivering) fosforylering av IRS1 blitt notert i musklene til individer med type 2 diabetes mellitus og IR. Mer nylig har aktivering av den nukleære respiratoriske faktor-2 (NRF2)-Keap1-banen (forbedring av mitokondrielt oksygenforbruk, ATP-produksjon og beta-oksidasjon av fettsyrer) vist seg å redusere glukoseopptak og IR.

Eksperimentelle tilnærminger: De samme eksperimentelle gruppene og eksperimentelle design som beskrevet i mål 1 vil bli brukt. A) For å undersøke mekanismene som er ansvarlige for reduksjon av mitokondriell aktivitet i PAH skjelettmuskulatur, vil uttrykket av flere sentrale transkripsjonsfaktorer og koregulatorer som er kjent for å regulere mitokondriell biogenese bli undersøkt, inkludert PPARγ coactivator 1α (PGC-1α), NRF-2, og mitokondriell transkripsjonsfaktor A (WB og immunutfellingsanalyse). Mitokondriell oksidativ (citratsyntase, heksokinase) og glykolytisk (laktatdehydrogenase, fosfofruktokinase) enzymaktivitet (spektrofotometriske teknikker) vil også bli vurdert. B) For å vurdere den potensielle rollen til IRS-1 serin-fosforylering i patogenesen av IR, vil etterforskerne også undersøke IRS-1 serin-fosforylering på flere serinrester (Ser307, Ser312, Ser616, Ser636) som har vært implisert å forstyrre med insulinsignalering in vitro (WB). PKCθ-ekspresjon og aktivitet vil bli vurdert ved bruk av isoformspesifikke PKC-antistoffer (WB) og et PKC-enzymanalysesett.

Tolkning: Forskerne forventer å demonstrere at: 1) PAH-pasienter viser redusert ekspresjon/aktivering av PPARγ1α og NRF-2, økt fosforylering av IRS-1 på kritiske serinsteder og PKCθ-aktivering, noe som fører til et metabolsk skifte mot glykolyse; 2) disse abnormitetene dominerer blant PAH-MS-pasienter sammenlignet med PAH uten MS.

Alternativ tilnærming: PKCθ-aktivering har hovedsakelig vært assosiert med MS. Imidlertid kan de samme eksperimentene gjøres for andre medlemmer av PKC-genfamilien. I tilfelle "klassiske MS-veier" beskrevet ovenfor ikke tar hensyn til IR/MS i PAH, vil rollen til skjelettmuskulaturen som kobler Protein-2 og Sirtuin-3, som nylig har blitt implisert i både IR/MS og PAH, være utforsket.