Nieprawidłowości mitochondrialne mięśni szkieletowych i zespół metaboliczny w PAH

CEL 1:

Aby określić, czy stwardnienie rozsiane jest związane z wewnątrzmięśniową akumulacją lipidów i upośledzonym metabolizmem i perfuzją mięśni szkieletowych w ludzkim PAH.

Uzasadnienie: Stwardnienie rozsiane i IR są bardzo rozpowszechnione wśród pacjentów z PAH, nawet przy braku otyłości i cukrzycy. W literaturze istnieje kilka linii dowodów na to, że IR rozwija się wraz z akumulacją metabolitów kwasów tłuszczowych w tkankach reagujących na insulinę, zwłaszcza wewnątrzkomórkowego odkładania się lipidów w mięśniach szkieletowych. Chociaż mechanizm odpowiadający za akumulację lipidów pozostaje nieuchwytny, zaproponowano zmniejszenie utleniania lipidów w wyniku zmniejszenia gęstości mitochondriów. Cele Celu 1 to 1) potwierdzenie, że u pacjentów z PAH występuje zwiększona akumulacja lipidów wewnątrzmięśniowych; 2) ustalenie, czy wewnątrzmięśniowa akumulacja lipidów jest związana z zaburzeniami metabolizmu mięśni szkieletowych; 3) aby wykazać, że te nieprawidłowości korelują ze stwardnieniem rozsianym i IR oraz funkcją mięśni szkieletowych wśród pacjentów z PAH.

Podejścia eksperymentalne: Proponowane eksperymenty zostaną przeprowadzone na pacjentach z PAH (n=10-20) w porównaniu z 10 zdrowymi, ale prowadzącymi siedzący tryb życia osobami dobranymi pod względem wieku, płci, wzrostu i wagi (definicja oparta na aktualnych zaleceniach), z wyłączeniem pacjentów z istotnymi klinicznie schorzeniami ( np. cukrzyca). Osoby te są stale identyfikowane poprzez nasz systematyczny proces biobankowania osocza w czasie cewnikowania prawego serca (CER#20735), w którym około 40% pacjentów z PAH bez otyłości/cukrzycy ma stwardnienie rozsiane. Oprócz rutynowo wykonywanych analiz: A) zostanie pobrana próbka krwi na obecność apolipoproteiny A1, apolipoproteiny B, hemoglobiny glikowanej, glukozy we krwi na czczo, insuliny, adiponektyny i leptyny. B) Obrazowanie MR zostanie użyte do oceny nacieku tłuszczu w obrębie mięśnia czworogłowego uda, wątroby i serca (szczegóły w załączniku). C) Siła wolicjonalna i niezależna oraz wytrzymałość dominującego mięśnia czworogłowego uda i VO2peak na ergometrze rowerowym zostaną ocenione, jak opisano wcześniej. D) Pobrane zostaną próbki biopsji przezskórnej mięśnia obszernego bocznego nogi niedominującej. Część próbki (≈100 mg) zostanie wykorzystana do immunohistochemicznego typowania włókien (technika modyfikowana etanolem), kapilaryzacji (ilościowe IF przy użyciu przeciwciała CD31) i wewnątrzkomórkowej akumulacji lipidów (barwienie czerwienią olejową O, która barwi tylko najbardziej hydrofobowe i neutralne lipidy, jak opisali wcześniej badacze. Analizator strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse XF24 zostanie zastosowany do pozostałych tkanek do pomiarów w czasie rzeczywistym zużycia tlenu i tempa zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (glikolizy). Aby upewnić się, że brak aktywności fizycznej nie jest odpowiedzialny za gromadzenie się lipidów w mięśniach szkieletowych, codzienna aktywność fizyczna badanych będzie obiektywnie oceniana ilościowo w ciągu jednego tygodnia za pomocą monitora aktywności fizycznej (opaska SenseWear®).

Interpretacja: To multimodalne podejście zapewni wyczerpujące informacje potwierdzające: 1) pacjenci z PAH wykazują znaczny wzrost akumulacji lipidów w mięśniu czworogłowym uda w porównaniu z grupą kontrolną; 2) zwiększona akumulacja lipidów w mięśniach szkieletowych pacjentów z PAH z SM w porównaniu z PAH bez SM pomimo podobnego poziomu aktywności fizycznej; 3) Akumulacja lipidów jest związana ze zmniejszeniem utleniania lipidów in vivo; 4) Funkcja MS/IR i mięśnia czworogłowego jest skorelowana z akumulacją lipidów w mięśniach/zdolnością fosforylacji oksydacyjnej glukozy.

Wielkość próby i analiza: Porównania między grupami zostaną przeprowadzone przy użyciu jednokierunkowej analizy ANOVA, po której nastąpi post-test Tukeya-Kramera, po potwierdzeniu normalności/równych wariancji (test Levene'a). 10 osób/grupę pozwoli na wykrycie 1,5 ± 0,5-krotnego wzrostu akumulacji lipidów w mięśniu czworogłowym uda, ocenianej za pomocą MRI (pierwotny wynik) z błędami typu 1 i 2 wynoszącymi 5% i 15%. Opierając się na naszych wstępnych danych (ryc. 3C), szacunki te są konserwatywne.

Podejście alternatywne: Działanie insuliny w wątrobie ma wiele podobieństw z działaniem insuliny w mięśniach. Chociaż nasza propozycja koncentruje się na mięśniach szkieletowych, coraz częściej uznaje się, że ektopowa akumulacja lipidów w wątrobie przyczynia się do stwardnienia rozsianego i IR. Ponieważ sekwencje MRI do oceny nacieku tłuszczu zajmują tylko kilka minut, otłuszczenie wątroby i jamy brzusznej zostanie ocenione podczas tego samego badania MR, jak opisano wcześniej.

CEL 2:

Aby ocenić, czy IR i MS są związane z defektami sygnalizacji insuliny w mięśniach szkieletowych PAH.

Uzasadnienie: Liczne badania potwierdziły zmniejszenie ekspresji koaktywatora receptora aktywowanego przez proliferatory peroksysomów (PPAR) γ 1α w mięśniach pacjentów z cukrzycą typu 2, zmniejszając mitochondrialne utlenianie kwasów tłuszczowych, które sprzyja gromadzeniu się diacyloglicerolu w mięśniach. W mięśniach szkieletowych insulina wiąże się ze swoim receptorem, aktywując aktywność receptorowej kinazy tyrozynowej, z następczą fosforylacją i aktywacją substratu receptora insuliny 1 (IRS1), ostatecznie promując dokowanie i fuzję pęcherzyków zawierających transporter glukozy (GLUT4) z osoczem membrana. Wykazano, że nagromadzenie wewnątrzkomórkowego diacyloglicerolu specyficznie aktywuje kinazy białkowe C (PKC) θ, powodując zmniejszenie fosforylacji tyrozyny IRS1. Konsekwentnie, w mięśniach osób z cukrzycą typu 2 i IR odnotowano aktywację mięśniowej PKCθ i zwiększoną fosforylację seryny (inaktywację) IRS1. Niedawno wykazano, że aktywacja szlaku jądrowego czynnika oddechowego-2 (NRF2)-Keap1 (poprawa mitochondrialnego zużycia tlenu, produkcja ATP i beta-oksydacja kwasów tłuszczowych) zmniejsza wychwyt glukozy i IR.

Podejścia eksperymentalne: Wykorzystane zostaną te same grupy eksperymentalne i schemat eksperymentu, jak opisano w celu 1. A) W celu zbadania mechanizmów odpowiedzialnych za zmniejszenie aktywności mitochondriów w mięśniach szkieletowych PAH zbadana zostanie ekspresja kilku kluczowych czynników transkrypcyjnych i koregulatorów, o których wiadomo, że regulują biogenezę mitochondriów, w tym koaktywatora PPARγ 1α (PGC-1α), NRF-2 i mitochondrialny czynnik transkrypcyjny A (test WB i immunoprecypitacji). Oceniona zostanie również aktywność mitochondrialnych enzymów oksydacyjnych (syntaza cytrynianowa, heksokinaza) i glikolitycznych (dehydrogenaza mleczanowa, fosfofruktokinaza) (technikami spektrofotometrycznymi). B) Aby ocenić potencjalną rolę fosforylacji seryny IRS-1 w patogenezie IR, badacze zbadają również fosforylację seryny IRS-1 na kilku resztach seryny (Ser307, Ser312, Ser616, Ser636), które mogą zakłócać z sygnalizacją insulinową in vitro (WB). Ekspresja i aktywność PKCθ zostaną ocenione przy użyciu przeciwciał PKC swoistych dla izoform (WB) i zestawu do oznaczania enzymów PKC.

Interpretacja: Badacze spodziewają się wykazać, że: 1) pacjenci z PAH wykazują zmniejszoną ekspresję/aktywację PPARγ1α i NRF-2, zwiększoną fosforylację IRS-1 w krytycznych miejscach seryny i aktywację PKCθ, co prowadzi do przesunięcia metabolicznego w kierunku glikolizy; 2) te nieprawidłowości dominują wśród pacjentów z PAH-SM w porównaniu z PAH bez SM.

Alternatywne podejście: aktywacja PKCθ była głównie związana ze stwardnieniem rozsianym. Jednak te same eksperymenty można przeprowadzić dla innych członków rodziny genów PKC. W przypadku, gdy opisane powyżej „klasyczne szlaki MS” nie uwzględniają IR/MS w PAH, rola białka rozprzęgającego-2 i sirtuiny-3 w mięśniach szkieletowych, które ostatnio powiązano zarówno z IR/MS, jak i PAH, będzie zbadane.