Skeletmuskel mitokondrielle abnormiteter og det metaboliske syndrom i PAH

MÅL 1:

At bestemme, om MS er forbundet med intramuskulær lipidakkumulering og nedsat skeletmuskelmetabolisme og perfusion i human PAH.

Begrundelse: MS og IR er meget udbredt blandt PAH-patienter, selv i fravær af fedme og diabetes. Der er adskillige beviser i litteraturen for, at IR udvikler sig med akkumulering af fedtsyremetabolitter i insulin-reagerende væv, især intramyocellulær lipidaflejring i skeletmuskler. Selvom den mekanisme, der tegner sig for lipidakkumulering, forbliver uhåndgribelig, er en reduktion i lipidoxidation som følge af reduktion i mitokondriel tæthed blevet foreslået. Formålet med mål 1 er 1) at bekræfte, at PAH-patienter har øget intramuskulær lipidakkumulering; 2) at bestemme, om intramuskulær lipidakkumulering er forbundet med nedsat skeletmuskelmetabolisme; 3) at demonstrere, at disse abnormiteter korrelerer med MS og IR og skeletmuskelfunktion blandt PAH-patienter.

Eksperimentelle tilgange: De foreslåede eksperimenter vil blive udført på PAH-patienter (n=10-20) vs. 10 raske, men stillesiddende forsøgspersoner matchet for alder, køn, højde og vægt (definition baseret på nuværende anbefalinger), ekskl. patienter med klinisk relevante tilstande ( for eksempel. diabetes). Disse individer identificeres løbende gennem vores systematiske plasmabiobankproces på tidspunktet for kateterisering af højre hjerte (CER#20735), hvor omkring 40 % af PAH-patienter uden fedme/diabetes har MS. Ud over rutinemæssigt udførte analyser: A) vil der blive udtaget blodprøver for Apolipoprotein A1, Apolipoprotein B, glykeret hæmoglobin, fastende blodsukker, insulin, adiponectin og leptin. B) MR-billeddannelse vil blive brugt til at vurdere fedtinfiltration i quadriceps-musklen, leveren og hjertet (se appendiks for detaljer). C) Viljemæssig og ikke-viljemæssig styrke og udholdenhed af de dominante quadriceps og VO2peak på cykelergometer vil blive vurderet, som tidligere beskrevet. D) Der vil blive taget perkutane biopsiprøver af vastus lateralis-muskelen i det ikke-dominante ben. En del af prøven (≈100mg) vil blive brugt til immunhistokemisk fibertypebestemmelse (ethanolmodificeret teknik), kapillarisering (kvantitativ IF ved brug af CD31-antistof) og intramyocellulær lipidakkumulering (olierød O-farvning, som kun farver de mest hydrofobe og neutrale lipider, som efterforskerne tidligere har beskrevet. Den ekstracellulære fluxanalysator Seahorse XF24 vil blive brugt på de resterende væv til realtidsmålinger af iltforbrug og ekstracellulære forsuringshastigheder (glykolyse). For at sikre, at fysisk inaktivitet ikke er ansvarlig for ophobning af fedt i skeletmuskulaturen, vil forsøgspersoners daglige fysiske aktiviteter blive objektivt kvantificeret i løbet af en uge ved hjælp af en fysisk aktivitetsmonitor (SenseWear® armbånd).

Fortolkning: Denne multimodalitetstilgang vil give omfattende information til at bekræfte: 1) PAH-patienter udviser signifikante stigninger i quadriceps muskellipidakkumulering sammenlignet med kontroller; 2) lipidakkumulering er øget i skeletmuskulaturen hos PAH-patienter med MS sammenlignet med PAH uden MS på trods af tilsvarende niveauer af fysisk aktivitet; 3) Lipidakkumulering er forbundet med en reduktion i lipidoxidation in vivo; 4) MS/IR og quadriceps muskelfunktion korrelerer med muskellipidakkumulering/glukoseoxidativ fosforyleringskapacitet.

Prøvestørrelse og analyse: Sammenligninger mellem grupper vil blive udført ved hjælp af envejs ANOVA efterfulgt af en Tukey-Kramer post-test, efter bekræftelse af normalitet/lige varianser (Levenes test). 10 forsøgspersoner/gruppe vil tillade påvisning af en 1,5±0,5 gange stigning i quadriceps muskellipidakkumulering vurderet ved MR (primært resultat) med type 1 og 2 fejl på 5% og 15%. Baseret på vores foreløbige data (Fig.3C) er disse estimater konservative.

Alternativ tilgang: Insulinvirkning i leveren har mange ligheder med insulinvirkning i muskler. Selvom vores forslag fokuserer på skeletmuskler, anerkendes ektopisk lipidakkumulering i leveren også i stigende grad som bidragende til MS og IR. Da MR-sekvenser til at vurdere fedtinfiltration kun tager få minutter, vil lever- og abdominalfedt blive vurderet under den samme MR-undersøgelse, som tidligere beskrevet.

MÅL 2:

At vurdere om IR og MS er relateret til defekter i insulinsignalering i PAH skeletmuskulatur.

Begrundelse: Talrige undersøgelser bekræftede en reduktion i ekspression af den peroxisomproliferator-aktiverede receptor (PPAR) γ coactivator 1α i musklerne hos patienter med type 2 diabetes mellitus, hvilket reducerer den mitokondrielle fedtsyreoxidation, der fremmer akkumuleringen af ​​diacylglycerol i musklen. I skeletmuskler binder insulin til dets receptor, aktiverer receptortyrosinkinaseaktiviteten med efterfølgende phosphorylering og aktivering af insulinreceptorsubstrat 1 (IRS1), hvilket i sidste ende fremmer docking og fusion af glucosetransporter (GLUT4)-holdige vesikler til plasmaet membran. Akkumulering af intracellulær diacylglycerol har vist sig specifikt at aktivere proteinkinaser C (PKC) θ, hvilket resulterer i reduktion i tyrosinphosphorylering af IRS1. Konsekvent er aktivering af muskel PKCθ og øget serin (inaktivering) phosphorylering af IRS1 blevet noteret i musklerne hos personer med type 2 diabetes mellitus og IR. For nylig har aktiveringen af ​​den nukleare respiratoriske faktor-2 (NRF2)-Keap1-vej (forbedring af mitokondrielt iltforbrug, ATP-produktion og beta-oxidation af fedtsyrer) vist sig at reducere glukoseoptagelse og IR.

Eksperimentelle tilgange: De samme eksperimentelle grupper og eksperimentelle design som beskrevet i mål 1 vil blive brugt. A) For at undersøge de mekanismer, der er ansvarlige for reduktionen af ​​mitokondriel aktivitet i PAH-skeletmuskler, vil ekspressionen af ​​flere centrale transkriptionsfaktorer og coregulatorer, der vides at regulere mitokondriel biogenese, blive undersøgt, herunder PPARγ coactivator 1α (PGC-1α), NRF-2 og mitokondriel transkriptionsfaktor A (WB og immunpræcipitationsassay). Mitokondriel oxidativ (citratsyntase, hexokinase) og glykolytisk (lactatdehydrogenase, phosphofructokinase) enzymaktivitet (spektrofotometriske teknikker) vil også blive vurderet. B) For at vurdere den potentielle rolle af IRS-1 serinphosphorylering i patogenesen af ​​IR, vil efterforskerne også undersøge IRS-1 serinphosphorylering på adskillige serinrester (Ser307, Ser312, Ser616, Ser636), som er blevet impliceret til at interferere med insulinsignalering in vitro (WB). PKCθ ekspression og aktivitet vil blive vurderet ved hjælp af isoform-specifikke PKC antistoffer (WB) og et PKC enzym assay kit.

Fortolkning: Forskerne forventer at demonstrere, at: 1) PAH-patienter udviser reduceret ekspression/aktivering af PPARγ1α og NRF-2, øget phosphorylering af IRS-1 på kritiske serinsteder og PKCθ-aktivering, hvilket fører til et metabolisk skift mod glykolyse; 2) disse abnormiteter dominerer blandt PAH-MS-patienter sammenlignet med PAH uden MS.

Alternativ tilgang: PKCθ-aktivering er overvejende blevet forbundet med MS. Imidlertid kunne de samme eksperimenter udføres for andre medlemmer af PKC-genfamilien. I tilfælde af, at "klassiske MS-veje" beskrevet ovenfor ikke tager højde for IR/MS i PAH, vil rollen som skeletmuskulaturens afkoblingsprotein-2 og Sirtuin-3, som for nylig er blevet impliceret i både IR/MS og PAH, være udforsket.