Anomalie mitocondriali del muscolo scheletrico e sindrome metabolica nella PAH

OBIETTIVO 1:

Per determinare se la SM è associata all'accumulo di lipidi intramuscolari e al metabolismo e alla perfusione del muscolo scheletrico alterato nella PAH umana.

Razionale: MS e IR sono altamente prevalenti tra i pazienti con PAH anche in assenza di obesità e diabete. Esistono diverse linee di evidenza in letteratura che l'IR si sviluppa con l'accumulo di metaboliti degli acidi grassi all'interno dei tessuti sensibili all'insulina, in particolare la deposizione di lipidi intramiocellulari all'interno dei muscoli scheletrici. Sebbene il meccanismo che tiene conto dell'accumulo di lipidi rimanga sfuggente, è stata proposta una riduzione dell'ossidazione dei lipidi come risultato della riduzione della densità mitocondriale. Gli obiettivi dell'obiettivo 1 sono 1) confermare che i pazienti con PAH hanno un aumento dell'accumulo di lipidi intramuscolari; 2) determinare se l'accumulo di lipidi intramuscolari è associato a un alterato metabolismo del muscolo scheletrico; 3) per dimostrare che queste anomalie sono correlate con SM e IR e la funzione dei muscoli scheletrici tra i pazienti affetti da PAH.

Approcci sperimentali: Gli esperimenti proposti saranno eseguiti su pazienti affetti da PAH (n=10-20) rispetto a 10 soggetti sani ma sedentari appaiati per età, sesso, altezza e peso (definizione basata sulle attuali raccomandazioni), esclusi i pazienti con condizioni clinicamente rilevanti ( per esempio. diabete). Questi individui vengono continuamente identificati attraverso il nostro sistematico processo di biobancaggio del plasma al momento del cateterismo del cuore destro (CER#20735), in cui circa il 40% dei pazienti affetti da PAH senza obesità/diabete ha la SM. Oltre alle analisi eseguite di routine: A) verranno prelevati campioni di sangue per Apolipoproteina A1, Apolipoproteina B, emoglobina glicata, glicemia a digiuno, insulina, adiponectina e leptina. B) L'imaging RM sarà utilizzato per valutare l'infiltrazione di grasso all'interno del muscolo quadricipite, del fegato e del cuore (vedi appendice per i dettagli). C) Verranno valutate la forza volitiva e non volitiva e la resistenza del quadricipite dominante e il VO2peak al cicloergometro, come precedentemente descritto. D) Verranno prelevati campioni bioptici percutanei del muscolo vasto laterale della gamba non dominante. Parte del campione (≈100 mg) verrà utilizzata per la tipizzazione immunoistochimica delle fibre (tecnica modificata con etanolo), la capillarizzazione (IF quantitativo utilizzando l'anticorpo CD31) e l'accumulo di lipidi intramiocellulari (colorazione Oil red O, che colora solo i lipidi più idrofobi e neutri, come descritto in precedenza dagli investigatori. L'analizzatore di flusso extracellulare Seahorse XF24 verrà utilizzato sui restanti tessuti per misurazioni in tempo reale del consumo di ossigeno e dei tassi di acidificazione extracellulare (glicolisi). Per garantire che l'inattività fisica non sia responsabile dell'accumulo di lipidi nel muscolo scheletrico, le attività fisiche quotidiane dei soggetti saranno oggettivamente quantificate durante una settimana utilizzando un monitor dell'attività fisica (fascia da braccio SenseWear®).

Interpretazione: questo approccio multimodale fornirà informazioni complete per confermare: 1) i pazienti affetti da PAH presentano aumenti significativi dell'accumulo di lipidi nel muscolo quadricipite rispetto ai controlli; 2) l'accumulo di lipidi è aumentato all'interno del muscolo scheletrico dei pazienti affetti da PAH con SM rispetto ai pazienti affetti da PAH senza SM nonostante livelli simili di attività fisica; 3) L'accumulo di lipidi è associato a una riduzione dell'ossidazione dei lipidi in vivo; 4) MS/IR e funzione del muscolo quadricipite correlano con l'accumulo di lipidi muscolari/capacità di fosforilazione ossidativa del glucosio.

Dimensione del campione e analisi: I confronti tra i gruppi saranno eseguiti utilizzando ANOVA unidirezionale seguita da un post-test di Tukey-Kramer, dopo la conferma della normalità/uguale varianza (test di Levene). 10 soggetti/gruppo consentiranno di rilevare un aumento di 1,5 ± 0,5 volte dell'accumulo di lipidi muscolari del quadricipite valutato mediante risonanza magnetica (esito primario) con errori di tipo 1 e 2 del 5% e del 15%. Sulla base dei nostri dati preliminari (Fig.3C), queste stime sono prudenti.

Approccio alternativo: l'azione dell'insulina nel fegato ha molte somiglianze con l'azione dell'insulina nei muscoli. Sebbene la nostra proposta si concentri sui muscoli scheletrici, anche l'accumulo ectopico di lipidi nel fegato è sempre più riconosciuto come un contributo alla SM e all'IR. Poiché le sequenze MRI per valutare l'infiltrazione di grasso richiedono solo pochi minuti, l'adiposità epatica e addominale sarà valutata durante lo stesso studio di esame RM, come descritto in precedenza.

OBIETTIVO 2:

Per valutare se IR e MS sono correlati a difetti nella segnalazione dell'insulina all'interno dei muscoli scheletrici della PAH.

Motivazione: Numerosi studi hanno confermato una riduzione dell'espressione del coattivatore 1α del recettore attivato dal proliferatore del perossisoma (PPAR) γ nei muscoli dei pazienti con diabete mellito di tipo 2, riducendo l'ossidazione degli acidi grassi mitocondriali che promuove l'accumulo di diacilglicerolo all'interno del muscolo. Nei muscoli scheletrici, l'insulina si lega al suo recettore, attivando l'attività della tirosina chinasi del recettore, con successiva fosforilazione e attivazione del substrato 1 del recettore dell'insulina (IRS1), promuovendo infine l'aggancio e la fusione delle vescicole contenenti il ​​trasportatore del glucosio (GLUT4) al plasma membrana. È stato dimostrato che l'accumulo di diacilglicerolo intracellulare attiva in modo specifico le protein chinasi C (PKC) θ, con conseguente riduzione della fosforilazione in tirosina di IRS1. Coerentemente, l'attivazione del muscolo PKCθ e l'aumento della fosforilazione della serina (inattivazione) di IRS1 sono stati osservati nei muscoli di individui con diabete mellito di tipo 2 e IR. Più recentemente, è stato dimostrato che l'attivazione della via del fattore respiratorio nucleare-2 (NRF2)-Keap1 (migliorando il consumo di ossigeno mitocondriale, la produzione di ATP e la beta-ossidazione degli acidi grassi) riduce l'assorbimento di glucosio e l'IR.

Approcci sperimentali: Saranno utilizzati gli stessi gruppi sperimentali e gli stessi disegni sperimentali descritti nell'obiettivo 1. A) Al fine di esaminare i meccanismi responsabili della riduzione dell'attività mitocondriale nei muscoli scheletrici PAH, sarà esaminata l'espressione di diversi fattori trascrizionali chiave e coregolatori che sono noti per regolare la biogenesi mitocondriale, incluso il coattivatore PPARγ 1α (PGC-1α), NRF-2 e fattore di trascrizione mitocondriale A (test WB e immunoprecipitazione). Sarà inoltre valutata l'attività degli enzimi mitocondriali ossidativi (citrato sintasi, esochinasi) e glicolitici (lattato deidrogenasi, fosfofruttochinasi) (tecniche spettrofotometriche). B) Al fine di valutare il ruolo potenziale della fosforilazione della serina di IRS-1 nella patogenesi dell'IR, i ricercatori esamineranno anche la fosforilazione della serina di IRS-1 su diversi residui di serina (Ser307, Ser312, Ser616, Ser636) che sono stati implicati per interferire con segnalazione di insulina in vitro (WB). L'espressione e l'attività di PKCθ saranno valutate utilizzando anticorpi PKC specifici per isoforma (WB) e un kit di analisi enzimatica PKC.

Interpretazione: i ricercatori si aspettano di dimostrare che: 1) i pazienti affetti da PAH mostrano una ridotta espressione/attivazione di PPARγ1α e NRF-2, una maggiore fosforilazione di IRS-1 sui siti critici della serina e l'attivazione di PKCθ, portando a uno spostamento metabolico verso la glicolisi; 2) queste anomalie dominano tra i pazienti PAH-MS rispetto a PAH senza SM.

Approccio alternativo: l'attivazione di PKCθ è stata prevalentemente associata alla SM. Tuttavia, gli stessi esperimenti potrebbero essere fatti per altri membri della famiglia del gene PKC. Nel caso in cui i "percorsi classici della SM" descritti sopra non tengano conto dell'IR/MS nella PAH, il ruolo della proteina di disaccoppiamento del muscolo scheletrico-2 e della sirtuina-3, che sono stati recentemente implicati sia nell'IR/MS che nella PAH, sarà esplorato.