Skeletspier mitochondriale afwijkingen en het metabool syndroom bij PAH

DOEL 1:

Om te bepalen of MS geassocieerd is met intramusculaire ophoping van lipiden en een verminderd skeletspiermetabolisme en perfusie bij menselijke PAH.

Achtergrond: MS en IR komen veel voor bij PAH-patiënten, zelfs als er geen sprake is van obesitas en diabetes. Er zijn verschillende bewijzen in de literatuur dat IR zich ontwikkelt met de accumulatie van vetzuurmetabolieten in op insuline reagerende weefsels, met name intramyocellulaire lipide-afzetting in skeletspieren. Hoewel het mechanisme dat verantwoordelijk is voor de accumulatie van lipiden ongrijpbaar blijft, is een vermindering van de oxidatie van lipiden als gevolg van een vermindering van de mitochondriale dichtheid voorgesteld. De doelstellingen van doel 1 zijn 1) bevestigen dat PAH-patiënten een verhoogde intramusculaire vetophoping hebben; 2) om te bepalen of intramusculaire vetophoping geassocieerd is met een verstoord skeletspiermetabolisme; 3) om aan te tonen dat deze afwijkingen correleren met MS en IR en skeletspierfunctie bij PAH-patiënten.

Experimentele benaderingen: De voorgestelde experimenten zullen worden uitgevoerd op PAH-patiënten (n=10-20) vs. 10 gezonde maar sedentaire proefpersonen die overeenkomen voor leeftijd, geslacht, lengte en gewicht (definitie gebaseerd op huidige aanbevelingen), met uitsluiting van patiënten met klinisch relevante aandoeningen ( bijv. suikerziekte). Deze personen worden continu geïdentificeerd via ons systematische plasma-biobankproces op het moment van rechterhartkatheterisatie (CER#20735), waarbij ongeveer 40% van de PAH-patiënten zonder obesitas/diabetes MS heeft. Naast de routinematig uitgevoerde analyses: A) wordt er bloed afgenomen voor apolipoproteïne A1, apolipoproteïne B, geglyceerd hemoglobine, nuchtere bloedglucose, insuline, adiponectine en leptine. B) MR-beeldvorming zal worden gebruikt om vetinfiltratie in de quadricepsspier, de lever en het hart te beoordelen (zie appendix voor details). C) Willekeurige en niet-willekeurige kracht en uithoudingsvermogen van de dominante quadriceps en VO2peak op de fietsergometer zullen worden beoordeeld, zoals eerder beschreven. D) Er worden percutane biopsiemonsters genomen van de vastus lateralis-spier van het niet-dominante been. Een deel van het monster (≈100 mg) zal worden gebruikt voor immunohistochemische vezeltypering (met ethanol gemodificeerde techniek), capillarisatie (kwantitatieve IF met behulp van CD31-antilichaam) en intramyocellulaire lipidenaccumulatie (Oil red O-kleuring, die alleen de meest hydrofobe en neutrale lipiden kleurt, zoals de onderzoekers eerder beschreven. De extracellulaire fluxanalysator Seahorse XF24 zal worden gebruikt op de resterende weefsels voor real-time metingen van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring (glycolyse). Om er zeker van te zijn dat fysieke inactiviteit niet verantwoordelijk is voor de ophoping van lipiden in de skeletspieren, zullen de dagelijkse fysieke activiteiten van proefpersonen gedurende een week objectief worden gekwantificeerd met behulp van een fysieke activiteitsmonitor (SenseWear®-armband).

Interpretatie: Deze multimodaliteitsbenadering zal uitgebreide informatie verschaffen om te bevestigen: 1) PAH-patiënten vertonen een significante toename van de ophoping van lipiden in de quadriceps in vergelijking met controles; 2) vetophoping is verhoogd in de skeletspier van PAH-patiënten met MS in vergelijking met PAH zonder MS, ondanks vergelijkbare niveaus van fysieke activiteit; 3) Ophoping van lipiden gaat gepaard met een vermindering van de oxidatie van lipiden in vivo; 4) MS/IR- en quadriceps-spierfunctie correleren met spierlipide-accumulatie/glucose-oxidatieve-fosforyleringscapaciteit.

Steekproefomvang en analyse: vergelijkingen tussen groepen worden uitgevoerd met behulp van eenzijdige ANOVA, gevolgd door een Tukey-Kramer-posttest, na bevestiging van normaliteit/gelijke varianties (Levene's test). Met 10 proefpersonen/groep kan een 1,5 ± 0,5-voudige toename van de accumulatie van lipiden in de quadriceps worden gedetecteerd, beoordeeld met MRI (primair resultaat) met type 1- en 2-fouten van 5% en 15%. Op basis van onze voorlopige gegevens (figuur 3C) zijn deze schattingen conservatief.

Alternatieve benadering: De werking van insuline in de lever heeft veel overeenkomsten met de werking van insuline in spieren. Hoewel ons voorstel zich richt op skeletspieren, wordt ook steeds meer erkend dat ectopische vetophoping in de lever bijdraagt ​​aan MS en IR. Aangezien MRI-sequenties om vetinfiltratie te beoordelen slechts enkele minuten in beslag nemen, zullen lever- en abdominale adipositas worden beoordeeld tijdens hetzelfde MR-onderzoek, zoals eerder beschreven.

DOEL 2:

Om te beoordelen of IR en MS verband houden met defecten in insulinesignalering in PAH-skeletspieren.

Achtergrond: Talrijke studies bevestigden een verminderde expressie van de peroxisoom proliferator-geactiveerde receptor (PPAR) γ-coactivator 1α in de spieren van patiënten met diabetes mellitus type 2, waardoor de mitochondriale vetzuuroxidatie die de ophoping van diacylglycerol in de spier bevordert, wordt verminderd. In skeletspieren bindt insuline zich aan zijn receptor, waardoor de activiteit van receptortyrosinekinase wordt geactiveerd, met daaropvolgende fosforylering en activering van insuline-receptorsubstraat 1 (IRS1), wat uiteindelijk de koppeling en fusie van glucosetransporter (GLUT4) -bevattende blaasjes aan het plasma bevordert membraan. Er is aangetoond dat accumulatie van intracellulair diacylglycerol specifiek proteïnekinasen C (PKC) θ activeert, wat resulteert in een vermindering van de tyrosinefosforylering van IRS1. Consistent is activering van spier PKCθ en verhoogde serine (inactivatie) fosforylering van IRS1 waargenomen in de spieren van personen met type 2 diabetes mellitus en IR. Meer recentelijk is aangetoond dat de activering van de nucleaire ademhalingsfactor-2 (NRF2) -Keap1-route (verbetering van het mitochondriale zuurstofverbruik, ATP-productie en bèta-oxidatie van vetzuren) de opname van glucose en IR vermindert.

Experimentele benaderingen: Dezelfde experimentele groepen en experimentele opzet als beschreven in doel 1 zullen worden gebruikt. A) Om de mechanismen te onderzoeken die verantwoordelijk zijn voor de vermindering van mitochondriale activiteit in PAK-skeletspieren, zal de expressie van verschillende sleuteltranscriptiefactoren en coregulatoren waarvan bekend is dat ze de mitochondriale biogenese reguleren, worden onderzocht, waaronder PPARy-coactivator 1α (PGC-1α), NRF-2 en mitochondriale transcriptiefactor A (WB en immunoprecipitatietest). Mitochondriale oxidatieve (citraatsynthase, hexokinase) en glycolytische (lactaatdehydrogenase, fosfofructokinase) enzymenactiviteit (spectrofotometrische technieken) zullen ook worden beoordeeld. B) Om de mogelijke rol van IRS-1-serinefosforylering in de pathogenese van IR te beoordelen, zullen de onderzoekers ook IRS-1-serinefosforylering onderzoeken op verschillende serineresiduen (Ser307, Ser312, Ser616, Ser636) die betrokken zijn bij interferentie met insulinesignalering in vitro (WB). PKCθ-expressie en -activiteit zullen worden beoordeeld met behulp van isovorm-specifieke PKC-antilichamen (WB) en een PKC-enzymtestkit.

Interpretatie: De onderzoekers verwachten aan te tonen dat: 1) PAH-patiënten verminderde expressie/activering van PPARγ1α en NRF-2, verhoogde fosforylering van IRS-1 op kritieke serineplaatsen en PKCθ-activering vertonen, leidend tot een metabole verschuiving richting glycolyse; 2) deze afwijkingen domineren bij PAH-MS-patiënten in vergelijking met PAH zonder MS.

Alternatieve benadering: PKCθ-activering wordt voornamelijk in verband gebracht met MS. Dezelfde experimenten zouden echter kunnen worden gedaan voor andere leden van de PKC-genfamilie. In het geval dat "klassieke MS-pathways" zoals hierboven beschreven geen verklaring geven voor IR/MS bij PAH, zal de rol van de skeletspier die proteïne-2 en sirtuin-3 ontkoppelt, die recentelijk zijn betrokken bij zowel IR/MS als PAH, worden onderzocht. verkend.