Anomalías mitocondriales del músculo esquelético y síndrome metabólico en la HAP

OBJETIVO 1:

Determinar si la EM está asociada con la acumulación de lípidos intramusculares y el deterioro del metabolismo y la perfusión del músculo esquelético en la PAH humana.

Justificación: la EM y la RI son muy prevalentes entre los pacientes con HAP, incluso en ausencia de obesidad y diabetes. Hay varias líneas de evidencia en la literatura de que la RI se desarrolla con la acumulación de metabolitos de ácidos grasos dentro de los tejidos que responden a la insulina, especialmente la deposición de lípidos intramiocelulares dentro de los músculos esqueléticos. Aunque el mecanismo responsable de la acumulación de lípidos sigue siendo esquivo, se ha propuesto una reducción en la oxidación de lípidos como resultado de la reducción en la densidad mitocondrial. Los objetivos del Objetivo general 1 son 1) confirmar que los pacientes con HAP tienen una mayor acumulación de lípidos intramusculares; 2) determinar si la acumulación de lípidos intramusculares está asociada con el metabolismo del músculo esquelético alterado; 3) para demostrar que estas anomalías se correlacionan con la EM y la IR y la función del músculo esquelético entre los pacientes con HAP.

Enfoques experimentales: los experimentos propuestos se realizarán en pacientes con HAP (n = 10-20) frente a 10 sujetos sanos pero sedentarios de la misma edad, sexo, altura y peso (definición basada en las recomendaciones actuales), excluyendo pacientes con afecciones clínicamente relevantes ( p.ej. diabetes). Estos individuos se identifican continuamente a través de nuestro proceso sistemático de biobanco de plasma en el momento del cateterismo del corazón derecho (CER#20735), en el que aproximadamente el 40 % de los pacientes con PAH sin obesidad/diabetes tienen EM. Además de los análisis realizados de forma rutinaria: A) se extraerá una muestra de sangre para Apolipoproteína A1, Apolipoproteína B, hemoglobina glicosilada, glucosa en sangre en ayunas, insulina, adiponectina y leptina. B) Se usarán imágenes de RM para evaluar la infiltración de grasa dentro del músculo cuádriceps, el hígado y el corazón (consulte el apéndice para obtener más detalles). C) Se evaluará la fuerza y ​​resistencia volitivas y no volitivas del cuádriceps dominante y el VO2pico en cicloergómetro, como se describió anteriormente. D) Se tomarán muestras de biopsia percutánea del músculo vasto lateral de la pierna no dominante. Parte de la muestra (≈100 mg) se utilizará para inmunohistoquímica de tipificación de fibras (técnica modificada con etanol), capilarización (IF cuantitativa con anticuerpo CD31) y acumulación de lípidos intramiocelulares (tinción Oil red O, que tiñe solo los lípidos más hidrofóbicos y neutros, como los investigadores describieron anteriormente. El analizador de flujo extracelular Seahorse XF24 se utilizará en los tejidos restantes para medir en tiempo real el consumo de oxígeno y las tasas de acidificación extracelular (glucólisis). Para asegurar que la inactividad física no sea responsable de la acumulación de lípidos en el músculo esquelético, se cuantificará objetivamente la actividad física de la vida diaria de los sujetos durante una semana mediante un monitor de actividad física (brazalete SenseWear®).

Interpretación: este enfoque multimodal proporcionará información completa para confirmar: 1) los pacientes con HAP muestran aumentos significativos en la acumulación de lípidos en el músculo cuádriceps en comparación con los controles; 2) la acumulación de lípidos aumenta en el músculo esquelético de los pacientes con HAP y EM en comparación con los pacientes con HAP sin EM a pesar de niveles similares de actividad física; 3) la acumulación de lípidos está asociada con una reducción en la oxidación de lípidos in vivo; 4) La función muscular MS/IR y cuádriceps se correlaciona con la acumulación de lípidos musculares/capacidad de fosforilación oxidativa de glucosa.

Tamaño de la muestra y análisis: Las comparaciones entre grupos se realizarán mediante ANOVA unidireccional seguido de una prueba posterior de Tukey-Kramer, después de la confirmación de normalidad/igualdad de varianzas (prueba de Levene). 10 sujetos/grupo permitirán detectar un aumento de 1,5 ± 0,5 veces en la acumulación de lípidos en el músculo cuádriceps evaluado por resonancia magnética (resultado principal) con errores de tipo 1 y 2 del 5 % y 15 %. Según nuestros datos preliminares (Fig. 3C), estas estimaciones son conservadoras.

Enfoque alternativo: la acción de la insulina en el hígado tiene muchas similitudes con la acción de la insulina en el músculo. Aunque nuestra propuesta se centra en los músculos esqueléticos, también se reconoce cada vez más que la acumulación de lípidos ectópicos en el hígado contribuye a la EM y la IR. Dado que las secuencias de resonancia magnética para evaluar la infiltración de grasa toman solo unos minutos, la adiposidad hepática y abdominal se evaluará durante el mismo estudio de examen de resonancia magnética, como se describió anteriormente.

OBJETIVO 2:

Evaluar si la IR y la EM están relacionadas con defectos en la señalización de la insulina dentro de los músculos esqueléticos de PAH.

Justificación: Numerosos estudios confirmaron una reducción en la expresión del coactivador γ 1α del receptor activado por proliferador de peroxisomas (PPAR) en los músculos de pacientes con diabetes mellitus tipo 2, reduciendo la oxidación de ácidos grasos mitocondriales que promueve la acumulación de diacilglicerol dentro del músculo. En los músculos esqueléticos, la insulina se une a su receptor, lo que activa la actividad de la tirosina quinasa del receptor, con la subsiguiente fosforilación y activación del sustrato 1 del receptor de insulina (IRS1), lo que finalmente promueve el acoplamiento y la fusión de las vesículas que contienen el transportador de glucosa (GLUT4) al plasma. membrana. Se ha demostrado que la acumulación de diacilglicerol intracelular activa específicamente la proteína quinasa C (PKC) θ, lo que da como resultado una reducción en la fosforilación de tirosina de IRS1. De manera constante, se ha observado la activación de la PKCθ muscular y el aumento de la fosforilación de la serina (inactivación) de IRS1 en los músculos de las personas con diabetes mellitus tipo 2 e RI. Más recientemente, se ha demostrado que la activación de la vía del factor respiratorio nuclear 2 (NRF2)-Keap1 (que mejora el consumo de oxígeno mitocondrial, la producción de ATP y la beta-oxidación de ácidos grasos) reduce la captación de glucosa y la IR.

Enfoques experimentales: Se utilizarán los mismos grupos experimentales y diseño experimental descritos en el objetivo 1. A) Con el fin de examinar los mecanismos responsables de la reducción de la actividad mitocondrial en los músculos esqueléticos de PAH, se examinará la expresión de varios factores transcripcionales y correguladores clave que se sabe que regulan la biogénesis mitocondrial, incluido el coactivador 1α de PPARγ (PGC-1α), NRF-2 y factor de transcripción mitocondrial A (WB y ensayo de inmunoprecipitación). También se evaluará la actividad de enzimas oxidativas mitocondriales (citrato sintasa, hexoquinasa) y glucolíticas (lactato deshidrogenasa, fosfofructoquinasa) (técnicas espectrofotométricas). B) Con el fin de evaluar el papel potencial de la fosforilación de serina IRS-1 en la patogénesis de la RI, los investigadores también examinarán la fosforilación de serina IRS-1 en varios residuos de serina (Ser307, Ser312, Ser616, Ser636) que han sido implicados para interferir con señalización de insulina in vitro (WB). La expresión y la actividad de PKCθ se evaluarán utilizando anticuerpos PKC específicos de isoforma (WB) y un kit de ensayo de enzimas PKC.

Interpretación: los investigadores esperan demostrar que: 1) los pacientes con PAH muestran una expresión/activación reducida de PPARγ1α y NRF-2, mayor fosforilación de IRS-1 en sitios críticos de serina y activación de PKCθ, lo que conduce a un cambio metabólico hacia la glucólisis; 2) estas anomalías dominan entre los pacientes con HAP-EM en comparación con los pacientes con HAP sin EM.

Enfoque alternativo: la activación de PKCθ se ha asociado predominantemente con la EM. Sin embargo, se podrían realizar los mismos experimentos para otros miembros de la familia de genes PKC. En el caso de que las "vías clásicas de la EM" descritas anteriormente no tengan en cuenta la IR/EM en la PAH, el papel de la proteína desacopladora 2 y la sirtuina-3 del músculo esquelético, que recientemente se han implicado tanto en la IR/EM como en la PAH, será explorado