Luustolihasten mitokondrioiden poikkeavuudet ja metabolinen oireyhtymä PAH:ssa

TAVOITE 1:

Sen määrittämiseksi, liittyykö MS-tauti lihaksensisäiseen lipidien kertymiseen ja heikentyneeseen luustolihasten aineenvaihduntaan ja perfuusioon ihmisen PAH:ssa.

Perustelut: MS ja IR ovat erittäin yleisiä PAH-potilaiden keskuudessa jopa ilman lihavuutta ja diabetesta. Kirjallisuudessa on useita todisteita siitä, että IR kehittyy rasvahappometaboliittien kerääntyessä insuliinille reagoiviin kudoksiin, erityisesti lihassolujen sisäiseen lipidien kertymiseen luurankolihaksissa. Vaikka lipidien kertymistä vastaava mekanismi on edelleen vaikeaselkoinen, on ehdotettu lipidien hapettumisen vähenemistä mitokondrioiden tiheyden vähenemisen seurauksena. Tavoitteen 1 tavoitteet ovat 1) vahvistaa, että PAH-potilailla on lisääntynyt lihaksensisäinen lipidien kerääntyminen; 2) sen määrittämiseksi, liittyykö lihaksensisäinen lipidien kerääntyminen heikentyneeseen luustolihasten aineenvaihduntaan; 3) osoittaa, että nämä poikkeavuudet korreloivat MS- ja IR- ja luustolihasten toiminnan kanssa PAH-potilailla.

Kokeelliset lähestymistavat: Ehdotetut kokeet suoritetaan PAH-potilailla (n=10-20) verrattuna 10 terveeseen, mutta istuvaan koehenkilöön, jotka vastaavat ikää, sukupuolta, pituutta ja painoa (määritelmä perustuu nykyisiin suosituksiin), pois lukien potilaat, joilla on kliinisesti merkittäviä sairauksia ( esimerkiksi. diabetes). Näitä henkilöitä tunnistetaan jatkuvasti systemaattisen plasman biopankkiprosessimme avulla oikean sydämen katetrointihetkellä (CER#20735), jossa noin 40 %:lla PAH-potilaista, joilla ei ole liikalihavuutta tai diabetesta, on MS-tauti. Rutiininomaisesti suoritettavien analyysien lisäksi: A) otetaan verinäyte Apolipoproteiini A1:n, Apolipoproteiini B:n, glykoituneen hemoglobiinin, paastoverenglukoosin, insuliinin, adiponektiinin ja leptiinin varalta. B) MR-kuvausta käytetään rasvan tunkeutumisen arvioimiseen nelipäisessä lihaksessa, maksassa ja sydämessä (katso lisätietoja liitteestä). C) Hallitsevan nelipäisen reisilihaksen ja VO2-huippujen tahdonvoimainen ja ei-tahtoinen voima ja kestävyys pyöräergometrissä arvioidaan edellä kuvatulla tavalla. D) Perkutaaniset biopsianäytteet ei-dominantin jalan vastus lateralis -lihaksesta. Osa näytteestä (≈100mg) käytetään immunohistokemialliseen kuitutyypitykseen (etanolimodifioitu tekniikka), kapillaarisaatioon (kvantitatiivinen IF käyttäen CD31-vasta-ainetta) ja intramyosellulaariseen lipidien kertymiseen (Oil red O -värjäys, joka värjää vain hydrofobisimpia ja neutraalimpia lipidejä, kuten tutkijat aiemmin kuvasivat. Solunulkoista virtausanalysaattoria Seahorse XF24 käytetään jäljellä oleviin kudoksiin hapenkulutuksen ja solunulkoisen happamoitumisen (glykolyysin) reaaliaikaisiin mittauksiin. Sen varmistamiseksi, että fyysinen passiivisuus ei ole vastuussa luustolihasten lipidien kertymisestä, koehenkilöiden päivittäisen elämän fyysinen aktiivisuus mitataan objektiivisesti viikon aikana fyysisen aktiivisuusmittarin (SenseWear®-käsivarsinauha) avulla.

Tulkinta: Tämä multimodaalinen lähestymistapa tarjoaa kattavaa tietoa, joka vahvistaa: 1) PAH-potilailla on merkittävä lisääntyminen nelipäisen lihaksen lipidien kertymisessä verrokkeihin verrattuna; 2) lipidien kertyminen lisääntyy MS-tautia sairastavien PAH-potilaiden luustolihaksissa verrattuna PAH-potilaisiin ilman MS-tautia samanlaisista fyysisen aktiivisuuden tasoista huolimatta; 3) Lipidien kerääntyminen liittyy lipidien hapettumisen vähenemiseen in vivo; 4) MS/IR ja nelipäisen lihasten toiminta korreloi lihaksen lipidien kertymisen/glukoosin oksidatiivisen fosforylaatiokapasiteetin kanssa.

Näytteen koko ja analyysi: Ryhmien väliset vertailut suoritetaan käyttämällä yksisuuntaista ANOVA:ta, jota seuraa Tukey-Kramer-jälkitesti, sen jälkeen kun on varmistettu normaalisuus/yhtäsuuruiset varianssit (Levenen testi). 10 koehenkilöä/ryhmä mahdollistaa 1,5 ± 0,5-kertaisen lisääntymisen nelipäisen lihaksen lipidien kertymisessä MRI:llä arvioituna (ensisijainen tulos) tyypin 1 ja 2 virheillä 5 % ja 15 %. Alustavien tietojemme (kuva 3C) perusteella nämä arviot ovat varovaisia.

Vaihtoehtoinen lähestymistapa: Insuliinin vaikutuksella maksassa on monia yhtäläisyyksiä insuliinin vaikutuksen kanssa lihaksissa. Vaikka ehdotuksemme keskittyy luurankolihaksiin, myös kohdunulkoisen lipidien kertymisen maksaan tunnustetaan yhä enemmän MS-tautia ja IR:tä edistävän. Koska MRI-sekvenssit rasvainfiltraation arvioimiseksi vievät vain muutaman minuutin, maksan ja vatsan rasvaisuus arvioidaan saman kokeen MR-tutkimuksen aikana, kuten aiemmin on kuvattu.

TAVOITE 2:

Arvioida, liittyvätkö infrapuna- ja MS-tautiin insuliinin signaalin häiriöihin PAH-runkolihaksissa.

Perustelut: Lukuisat tutkimukset vahvistivat peroksisomiproliferaattorin aktivoiman reseptorin (PPAR) γ-koaktivaattorin 1α:n ilmentymisen vähenemisen tyypin 2 diabetes mellitusta sairastavien potilaiden lihaksissa, mikä vähentää mitokondrioiden rasvahappojen hapettumista, mikä edistää diasyyliglyserolin kertymistä lihakseen. Luurankolihaksissa insuliini sitoutuu reseptoriinsa aktivoiden reseptorin tyrosiinikinaasin aktiivisuuden, minkä jälkeen insuliinireseptorisubstraatti 1 (IRS1) fosforyloituu ja aktivoituu, mikä viime kädessä edistää glukoosinkuljettajaa (GLUT4) sisältävien vesikkelien kiinnittymistä ja fuusioitumista plasmaan. kalvo. Solunsisäisen diasyyliglyserolin kertymisen on osoitettu aktivoivan spesifisesti proteiinikinaaseja C (PKC) θ, mikä johtaa IRS1:n tyrosiinin fosforylaation vähenemiseen. Johdonmukaisesti lihasten PKCθ:n aktivoitumista ja IRS1:n lisääntynyttä seriinin (inaktivaatio) fosforylaatiota on havaittu tyypin 2 diabetes mellitus- ja IR-potilaiden lihaksissa. Viime aikoina ydinhengitystekijä-2 (NRF2)-Keap1-reitin aktivoitumisen (parantaa mitokondrioiden hapenkulutusta, ATP:n tuotantoa ja rasvahappojen beetahapetusta) on osoitettu vähentävän glukoosin ottoa ja IR:tä.

Kokeelliset lähestymistavat: Käytetään samoja koeryhmiä ja koesuunnittelua kuin tavoitteessa 1 on kuvattu. A) Jotta voitaisiin tutkia mekanismeja, jotka ovat vastuussa mitokondrioiden aktiivisuuden vähenemisestä PAH-luurankolihaksissa, tutkitaan useiden keskeisten transkriptionaalisten tekijöiden ja koregulaattorien, joiden tiedetään säätelevän mitokondrioiden biogeneesiä, ilmentymistä, mukaan lukien PPARγ-koaktivaattori 1α (PGC-1α), NRF-2 ja mitokondrioiden transkriptiotekijä A (WB ja immunosaostusmääritys). Arvioidaan myös mitokondrioiden oksidatiivisten (sitraattisyntaasi, heksokinaasi) ja glykolyyttisten (laktaattidehydrogenaasi, fosfofruktokinaasi) entsyymien aktiivisuutta (spektrofotometriset tekniikat). B) Arvioidakseen IRS-1-seriinifosforylaation mahdollista roolia IR:n patogeneesissä tutkijat tutkivat myös IRS-1-seriinifosforylaatiota useissa seriinitähteissä (Ser307, Ser312, Ser616, Ser636), joiden on oletettu häiritsevän. insuliinisignaloinnin kanssa in vitro (WB). PKCθ:n ilmentyminen ja aktiivisuus arvioidaan käyttämällä isoformispesifisiä PKC-vasta-aineita (WB) ja PKC-entsyymimäärityspakkausta.

Tulkinta: Tutkijat odottavat osoittavansa, että: 1) PAH-potilailla on vähentynyt PPARy1α:n ja NRF-2:n ekspressio/aktivaatio, lisääntynyt IRS-1:n fosforylaatio kriittisissä seriinikohdissa ja PKCθ-aktivaatio, mikä johtaa metaboliseen siirtymiseen kohti glykolyysiä; 2) nämä poikkeavuudet hallitsevat PAH-MS-potilaita verrattuna PAH-potilaisiin ilman MS-tautia.

Vaihtoehtoinen lähestymistapa: PKCθ-aktivaatio on liitetty pääasiassa MS-tautiin. Samat kokeet voitaisiin kuitenkin tehdä muille PKC-geeniperheen jäsenille. Jos edellä kuvatut "klassiset MS-reitit" eivät ota huomioon IR/MS-tautia PAH:ssa, luurankolihasten rooli, joka erottaa proteiini-2:n ja Sirtuiini-3:n, jotka on äskettäin liitetty sekä IR/MS- että PAH-tautiin. tutkittu.