Mitochondriale Anomalien der Skelettmuskulatur und das metabolische Syndrom bei PAH

ZIEL 1:

Es sollte bestimmt werden, ob MS mit intramuskulärer Lipidakkumulation und beeinträchtigtem Skelettmuskelstoffwechsel und -durchblutung bei menschlicher PAH assoziiert ist.

Begründung: MS und IR sind bei PAH-Patienten selbst ohne Fettleibigkeit und Diabetes weit verbreitet. In der Literatur gibt es mehrere Hinweise darauf, dass sich IR mit der Akkumulation von Fettsäuremetaboliten in Insulin-responsiven Geweben entwickelt, insbesondere intramyozellulärer Lipidablagerung in Skelettmuskeln. Obwohl der Mechanismus, der für die Lipidakkumulation verantwortlich ist, schwer fassbar bleibt, wurde eine Verringerung der Lipidoxidation als Ergebnis einer Verringerung der mitochondrialen Dichte vorgeschlagen. Die Ziele von Ziel 1 sind 1) die Bestätigung, dass PAH-Patienten eine erhöhte intramuskuläre Lipidakkumulation aufweisen; 2) um zu bestimmen, ob eine intramuskuläre Lipidakkumulation mit einem beeinträchtigten Skelettmuskelstoffwechsel verbunden ist; 3) um zu zeigen, dass diese Anomalien mit MS und IR und der Skelettmuskelfunktion bei PAH-Patienten korrelieren.

Experimentelle Ansätze: Die vorgeschlagenen Experimente werden an PAH-Patienten (n=10-20) im Vergleich zu 10 gesunden, aber sesshaften Probanden durchgeführt, die hinsichtlich Alter, Geschlecht, Größe und Gewicht (Definition basierend auf aktuellen Empfehlungen) abgestimmt sind, unter Ausschluss von Patienten mit klinisch relevanten Erkrankungen ( z.B. Diabetes). Diese Personen werden kontinuierlich durch unseren systematischen Plasma-Biobanking-Prozess zum Zeitpunkt der Rechtsherzkatheterisierung (CER#20735) identifiziert, bei der etwa 40 % der PAH-Patienten ohne Adipositas/Diabetes an MS leiden. Zusätzlich zu routinemäßig durchgeführten Analysen: A) Blutproben werden für Apolipoprotein A1, Apolipoprotein B, glykiertes Hämoglobin, Nüchternblutzucker, Insulin, Adiponectin und Leptin entnommen. B) Die MR-Bildgebung wird verwendet, um die Fettinfiltration innerhalb des Quadrizepsmuskels, der Leber und des Herzens zu beurteilen (Einzelheiten siehe Anhang). C) Willkürliche und unwillkürliche Kraft und Ausdauer des dominanten Quadrizeps und VO2peak auf dem Fahrradergometer werden wie zuvor beschrieben bewertet. D) Es werden perkutane Biopsieproben des Musculus vastus lateralis des nichtdominanten Beins entnommen. Ein Teil der Probe (≈100 mg) wird für die immunhistochemische Fasertypisierung (Ethanol-modifizierte Technik), die Kapillarisierung (quantitative IF mit CD31-Antikörper) und die intramyozelluläre Lipidakkumulation (Ölrot-O-Färbung, die nur die hydrophobsten und neutralsten Lipide färbt, verwendet. wie die Ermittler zuvor beschrieben haben. Der extrazelluläre Flussanalysator Seahorse XF24 wird an den verbleibenden Geweben für Echtzeitmessungen des Sauerstoffverbrauchs und der extrazellulären Ansäuerungsraten (Glykolyse) verwendet. Um sicherzustellen, dass körperliche Inaktivität nicht für die Lipidakkumulation in der Skelettmuskulatur verantwortlich ist, werden die täglichen körperlichen Aktivitäten der Probanden eine Woche lang mit einem Bewegungsmonitor (SenseWear®-Armband) objektiv quantifiziert.

Interpretation: Dieser multimodale Ansatz liefert umfassende Informationen zur Bestätigung: 1) PAH-Patienten weisen im Vergleich zu Kontrollen eine signifikante Zunahme der Lipidakkumulation im Quadrizepsmuskel auf; 2) die Lipidakkumulation im Skelettmuskel von PAH-Patienten mit MS im Vergleich zu PAH ohne MS trotz ähnlicher körperlicher Aktivität erhöht ist; 3) Lipidakkumulation ist mit einer Verringerung der Lipidoxidation in vivo verbunden; 4) MS/IR und Quadrizeps-Muskelfunktion korrelieren mit der Muskellipidakkumulation/Glucose-oxidativen Phosphorylierungskapazität.

Probengröße und Analyse: Vergleiche zwischen den Gruppen werden unter Verwendung einer einfachen ANOVA, gefolgt von einem Tukey-Kramer-Nachtest, nach Bestätigung der Normalität/gleichen Varianzen (Levene-Test) durchgeführt. 10 Probanden/Gruppe ermöglichen den Nachweis einer 1,5 ± 0,5-fachen Zunahme der Lipidakkumulation des Quadrizepsmuskels, bewertet durch MRT (primäres Ergebnis) mit Fehlern vom Typ 1 und 2 von 5 % und 15 %. Basierend auf unseren vorläufigen Daten (Abb. 3C) sind diese Schätzungen konservativ.

Alternativer Ansatz: Die Insulinwirkung in der Leber hat viele Ähnlichkeiten mit der Insulinwirkung im Muskel. Obwohl sich unser Vorschlag auf die Skelettmuskulatur konzentriert, wird auch die ektopische Lipidakkumulation in der Leber zunehmend als Beitrag zu MS und IR anerkannt. Da MRT-Sequenzen zur Beurteilung der Fettinfiltration nur wenige Minuten dauern, werden Leber- und abdominale Adipositas wie zuvor beschrieben während derselben MR-Untersuchung beurteilt.

ZIEL 2:

Um zu beurteilen, ob IR und MS mit Defekten in der Insulinsignalisierung in PAH-Skelettmuskeln zusammenhängen.

Begründung: Zahlreiche Studien bestätigten eine verringerte Expression des Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptors (PPAR) γ-Coaktivator 1α in den Muskeln von Patienten mit Typ-2-Diabetes mellitus, wodurch die mitochondriale Fettsäureoxidation verringert wird, die die Akkumulation von Diacylglycerin im Muskel fördert. In der Skelettmuskulatur bindet Insulin an seinen Rezeptor und aktiviert die Rezeptor-Tyrosinkinase-Aktivität mit anschließender Phosphorylierung und Aktivierung des Insulin-Rezeptor-Substrats 1 (IRS1), was letztendlich das Andocken und die Fusion von Glukosetransporter (GLUT4)-enthaltenden Vesikeln mit dem Plasma fördert Membran. Es wurde gezeigt, dass die Akkumulation von intrazellulärem Diacylglycerol spezifisch die Proteinkinasen C (PKC) θ aktiviert, was zu einer Verringerung der Tyrosinphosphorylierung von IRS1 führt. Konsequenterweise wurde eine Aktivierung von Muskel-PKCθ und eine erhöhte Serin-(Inaktivierung)-Phosphorylierung von IRS1 in den Muskeln von Personen mit Typ-2-Diabetes mellitus und IR festgestellt. In jüngerer Zeit wurde gezeigt, dass die Aktivierung des nuklearen Atmungsfaktors 2 (NRF2)-Keap1-Weg (Verbesserung des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs, der ATP-Produktion und der Beta-Oxidation von Fettsäuren) die Glukoseaufnahme und IR reduziert.

Versuchsansätze: Es werden die gleichen Versuchsgruppen und Versuchsaufbauten wie in Ziel 1 beschrieben verwendet. A) Um die Mechanismen zu untersuchen, die für die Verringerung der mitochondrialen Aktivität in PAH-Skelettmuskeln verantwortlich sind, wird die Expression mehrerer wichtiger Transkriptionsfaktoren und Koregulatoren untersucht, von denen bekannt ist, dass sie die mitochondriale Biogenese regulieren, einschließlich PPARγ-Coaktivator 1α (PGC-1α), NRF-2 und mitochondrialer Transkriptionsfaktor A (WB und Immunpräzipitationsassay). Mitochondriale oxidative (Citratsynthase, Hexokinase) und glykolytische (Lactatdehydrogenase, Phosphofructokinase) Enzymaktivität (spektrophotometrische Techniken) werden ebenfalls bewertet. B) Um die potenzielle Rolle der IRS-1-Serin-Phosphorylierung bei der Pathogenese von IR zu bewerten, werden die Forscher auch die IRS-1-Serin-Phosphorylierung an mehreren Serinresten (Ser307, Ser312, Ser616, Ser636) untersuchen, die mit einer Störung in Verbindung gebracht wurden mit Insulinsignalisierung in vitro (WB). PKCθ-Expression und -Aktivität werden unter Verwendung isoformspezifischer PKC-Antikörper (WB) und eines PKC-Enzym-Assay-Kits bewertet.

Interpretation: Die Prüfärzte erwarten zu zeigen, dass: 1) PAH-Patienten eine verringerte Expression/Aktivierung von PPARγ1α und NRF-2, eine erhöhte Phosphorylierung von IRS-1 an kritischen Serinstellen und eine PKCθ-Aktivierung aufweisen, was zu einer metabolischen Verschiebung in Richtung Glykolyse führt; 2) diese Anomalien dominieren bei PAH-MS-Patienten im Vergleich zu PAH ohne MS.

Alternativer Ansatz: Die PKCθ-Aktivierung wurde überwiegend mit MS in Verbindung gebracht. Die gleichen Experimente könnten jedoch für andere Mitglieder der PKC-Genfamilie durchgeführt werden. Für den Fall, dass die oben beschriebenen „klassischen MS-Wege“ IR/MS bei PAH nicht berücksichtigen, wird die Rolle von Skelettmuskel-Uncoupling-Protein-2 und Sirtuin-3, die kürzlich sowohl mit IR/MS als auch mit PAH in Verbindung gebracht wurden, eine Rolle spielen erforscht.