PAHにおける骨格筋ミトコンドリア異常とメタボリックシンドローム

目的 1:

MS が筋肉内脂質蓄積および骨格筋代謝障害とヒト PAH の灌流に関連しているかどうかを判断すること。

理論的根拠: MS と IR は、肥満や糖尿病がない場合でも、PAH 患者の間で非常に一般的です。 文献には、インスリン応答性組織内の脂肪酸代謝産物の蓄積、特に骨格筋内の筋細胞内脂質沈着によって IR が発生するといういくつかの証拠があります。 脂質蓄積を説明するメカニズムはとらえどころのないままですが、ミトコンドリア密度の減少の結果としての脂質酸化の減少が提案されています。 目的 1 の目的は、1) PAH 患者の筋肉内脂質蓄積が増加していることを確認することです。 2) 筋肉内脂質蓄積が骨格筋代謝障害と関連しているかどうかを判断する。 3) これらの異常が PAH 患者の MS および IR および骨格筋機能と相関することを実証すること。

実験的アプローチ: 提案された実験は、PAH 患者 (n = 10-20) に対して、年齢、性別、身長、体重 (現在の推奨事項に基づく定義) が一致する健康で座りがちな 10 人の被験者に対して実行されます。例えば 糖尿病）。 これらの個人は、肥満/糖尿病のない PAH 患者の約 40% が MS である右心カテーテル検査 (CER#20735) の時点で、体系的な血漿バイオバンキング プロセスを通じて継続的に特定されます。 定期的に実行される分析に加えて、A) アポリポタンパク質 A1、アポリポタンパク質 B、糖化ヘモグロビン、空腹時血糖、インスリン、アディポネクチン、およびレプチンの血液サンプルが採取されます。 B) MR イメージングを使用して、大腿四頭筋、肝臓、および心臓内の脂肪浸潤を評価します (詳細については、付録を参照してください)。 C) 前に説明したように、支配的な大腿四頭筋の自発的および非自発的な強度と持久力、およびサイクル エルゴメーターでの VO2peak が評価されます。 D) 非利き脚の外側広筋の経皮生検標本が採取されます。 標本の一部 (≈100mg) は、免疫組織化学繊維タイピング (エタノール修正技術)、キャピラリゼーション (CD31 抗体を使用した定量的 IF)、および筋細胞内脂質蓄積 (最も疎水性で中性の脂質のみを染色するオイルレッド O 染色) に使用されます。研究者が以前に説明したように。 残りの組織では、細胞外フラックス アナライザー Seahorse XF24 を使用して、酸素消費量と細胞外酸性化速度 (解糖) をリアルタイムで測定します。 運動不足が骨格筋の脂質蓄積の原因ではないことを確認するために、身体活動モニター (SenseWear® アームバンド) を使用して、被験者の日常生活における身体活動を 1 週間客観的に定量化します。

解釈: このマルチモダリティ アプローチは、確認するための包括的な情報を提供します。 2) 同じレベルの身体活動にもかかわらず、MS なしの PAH と比較して、MS ありの PAH 患者の骨格筋内の脂質蓄積が増加します。 3) 脂質の蓄積は、生体内での脂質酸化の減少と関連しています。 4) MS/IR および大腿四頭筋の機能は、筋肉の脂質蓄積/グルコース酸化的リン酸化能力と相関します。

サンプルサイズと分析: グループ間の比較は、正規性/等分散 (Levene の検定) の確認後、一方向 ANOVA とそれに続く Tukey-Kramer 事後検定を使用して実行されます。 10 人の被験者/グループは、5% および 15% のタイプ 1 および 2 のエラーで、MRI によって評価された大腿四頭筋の脂質蓄積の 1.5±0.5 倍の増加 (主要な結果) を検出することができます。 予備データ (図 3C) に基づくと、これらの推定値は保守的です。

別のアプローチ: 肝臓でのインスリン作用は、筋肉でのインスリン作用と多くの類似点があります。 私たちの提案は骨格筋に焦点を当てていますが、肝臓の異所性脂質蓄積も、MS と IR の一因としてますます認識されています。 脂肪浸潤を評価するための MRI シーケンスは数分しかかからないため、前述のように、同じ検査 MR 研究中に肝臓と腹部の脂肪が評価されます。

目的 2:

IR および MS が PAH 骨格筋内のインスリン シグナル伝達の欠陥に関連しているかどうかを評価すること。

理論的根拠: 多くの研究により、2型糖尿病患者の筋肉におけるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)γコアクチベーター1αの発現の減少が確認され、筋肉内のジアシルグリセロールの蓄積を促進するミトコンドリア脂肪酸の酸化が減少します。 骨格筋では、インスリンはその受容体に結合し、受容体チロシンキナーゼ活性を活性化し、続いてインスリン受容体基質 1 (IRS1) のリン酸化と活性化を行い、最終的にグルコース輸送体 (GLUT4) を含む小胞のプラズマへのドッキングと融合を促進します。膜。 細胞内ジアシルグリセロールの蓄積は、プロテインキナーゼ C (PKC) θ を特異的に活性化し、IRS1 のチロシンリン酸化を減少させることが示されています。 一貫して、筋肉 PKCθ の活性化と IRS1 のセリン (不活性化) リン酸化の増加が、2 型糖尿病および IR 患者の筋肉で認められています。 最近では、核呼吸因子-2 (NRF2)-Keap1 経路の活性化 (ミトコンドリアの酸素消費、ATP 産生、および脂肪酸のベータ酸化の改善) が、グルコースの取り込みと IR を減少させることが示されています。

実験的アプローチ: 目的 1 で説明したのと同じ実験グループと実験計画が使用されます。 A) PAH 骨格筋におけるミトコンドリア活性の低下の原因となるメカニズムを調べるために、ミトコンドリア生合成を調節することが知られているいくつかの重要な転写因子と補調節因子の発現を調べます。 NRF-2、およびミトコンドリア転写因子 A (WB および免疫沈降アッセイ)。 ミトコンドリアの酸化（クエン酸シンターゼ、ヘキソキナーゼ）および解糖（乳酸デヒドロゲナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ）酵素活性（分光光度法）も評価されます。 B) IR の病因における IRS-1 セリンリン酸化の潜在的な役割を評価するために、研究者は、干渉に関係しているいくつかのセリン残基 (Ser307、Ser312、Ser616、Ser636) での IRS-1 セリンリン酸化も調べます。インビトロでのインスリンシグナル伝達（WB）。 ＰＫＣθの発現および活性は、アイソフォーム特異的ＰＫＣ抗体（ＷＢ）およびＰＫＣ酵素アッセイキットを使用して評価される。

解釈: 研究者は、次のことを実証することを期待しています: 1) PAH患者は、PPARγ1αの発現/活性化の低下、NRF-2、重要なセリン部位でのIRS-1のリン酸化の増加、およびPKCθ活性化を示し、解糖への代謝シフトを引き起こします。 2) これらの異常は、MS のない PAH と比較して、PAH-MS 患者の間で優勢です。

代替アプローチ: PKCθ の活性化は、主に MS に関連しています。 ただし、PKC 遺伝子ファミリーの他のメンバーについても同じ実験を行うことができます。 上記の「古典的な MS 経路」が PAH の IR/MS を説明しない場合、最近 IR/MS と PAH の両方に関与している骨格筋 Uncoupling Protein-2 と Sirtuin-3 の役割は次のようになります。探索した。