干酪乳杆菌代田发酵乳对老年人肌肉减少症的影响

1.受试者入组肌肉减少症的定义基于亚洲肌肉减少症工作组(AWGS)的算法。

1. 肌肉质量：使用 Inbody S10 测量并按身高标准化，以骨骼肌指数显示 [SMI = 附肢肌肉质量 (kg)/身高 (m2)]。 低肌肉质量定义为：

   • 男性：SMI <7.0 kg/m2
   • 女性：SMI <5.4 kg/m2

2. 握力：用电子握力计测量。 低握力定义为：

   • 男性：<28 公斤
   • 女性：<18 公斤

3. 肢体力量：椅立法用Time测定5次。 低肢体力量定义为：

   • 椅子站立 5 次的时间：≧12s 肌肉减少症定义为 (1) 和 (2) 之一，或 (3)

     2.研究干预测试饮料包括由益力多公司（台湾台北）提供的用干酪乳杆菌菌株Shirota YIT9029（LCS）发酵的发酵乳。 饮料在 0-10°C 的温度范围内分发和储存。 发酵乳每 100 毫升瓶中含有超过 3x10^8 CFU 的 LCS。

参与者每天服用 2 瓶（104 大卡/天）。 研究干预应每天两次，大约在同一时间进行。 所有牛奶将每周发送给参与者（14 瓶/周）。

3.研究评估3-1人体测量和身体成分评估人体测量数据使用卷尺和体重秤测量身高、体重、腰围、手臂肌肉围、臀围和小腿围。

使用生物电阻抗分析 (BIA) 作为非侵入性测试仪器检测身体成分。

3-2 BIA 受试者赤脚站立。 手臂不要接触身体的躯干部分，自然地分开，与躯干成 15 度角。 手部电极标记为拇指的 THUMB 和中指的 MIDDLE。 足部电极应位于受检者的踝骨和脚跟之间。 电流由双脚脚跟和双手指尖上的电极供应。

3-3 肌肉力量 在标准条件下使用经过充分研究的手持式测力计模型和参考人群测量的握力可以可靠地替代小臂或腿部肌肉力量的更复杂测量。 测量采用电子手握式测力计。 男性的低握力定义为：<28 kg；女性：<18公斤。 椅子站立时用 Time 测量肢体力量 5 次。 受试者坐下和站立五次，并通过计时器计算时间。 下肢力量定义为5次椅立时间：≥12s。

3-4 体能表现 体能表现采用6 米通常步速、TUG 和SPPB 进行评估。

3-5 步速 参与者被指示从站立开始以对他们来说正常且舒适的步速行走，或者尽可能快地行走，直到参与者到达标记路径的尽头。 训练有素的考官走在参与者身后，并在步行课程结束时参与者的脚接触到地板时停止计时。 在整个测试期间，根据需要为参与者提供休息时间。 低 物理性能定义为 < 1 m/s。

3-6 TUG 参与者被要求从椅子上站起来，向前走 3 米，然后回到椅子上坐下。 低 物理性能定义为 ≧ 20s。

3-7 SPPB 参与者被跟踪到 SPPB 进行测试。 低体力表现定义为 ≦ 9 分。

3-8 细菌总数、肠道微生物群组成和微生物群衍生代谢物分析

3-8-1 16S V1-V2 测序 使用 CTAB/SDS 方法从粪便样本中提取样本的总基因组 DNA。 选择 16S rRNA 基因的 V1-V2 区域进行焦磷酸测序分析。

3-8-2 16S rRNA 基因序列分析 16S rRNA 基因序列数据使用QIIME v 1.8.0 使用默认参数进行处理。 序列以 97% 的相似性聚类为操作分类单元 (OTU)，然后使用 uclust 共识分类法分类器分配 Greengenes 分类法。

3-8-3 粪便短链脂肪酸粪便样品用去离子水稀释并匀化。 对于短链脂肪酸 (SCFA) 分析，使用了上清液。 使用 Adorno 等人的方法进行二乙醚提取。

3-8-4 IPA 和 TMAO 测定 研究人员使用 LC-MS/MS（4000 QTRAP，City，State，USA）分析了 IPA 的血清和粪便水平。

通过稳定同位素（DLM4779-1, Andover, MA, USA）稀释液相色谱串联质谱法检测血浆 TMAO 浓度（Ke et al., 2018）。

3-8-5 qPCR 总细菌数 根据 Shima 等人描述的方法，通过 qPCR 分析确定总细菌数。 (Beneficial Microbes, 2019) 使用正向引物 (UniF: GTGSTGCAYGGYYGTCGTCA) 和反向引物 (UniR: ACGTCRTCCMCNCCTTCTC) 组。 Faecalibacterium prausnitzii ATCC27768T 用作标准菌株。

3-9 血液生化分析

3-9-1 采血 试验前和试验后采集受试者的血液样本。 将血样置于含有抗凝剂 EDTA 和肝素的收集管中。

3-9-2 代谢参数 所有代谢测量均在干预开始前一天和干预结束时进行。 CBC、TSH、游离 T4、维生素 D、总胆固醇、HDL-胆固醇、LDL-胆固醇、甘油三酯、空腹血糖、空腹胰岛素、血尿素、氮、血浆前白蛋白、白蛋白、ALT、AST、HbA1c、HS-CRP、禁食至少 8 小时后测量骨钙素、脂联素、瘦素、血清素和肌酐。

3-9-3 血浆氨基酸分析研究人员使用 Hitachi L-8900 氨基酸分析仪（位置）检测和定量丙氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸和蛋氨酸。

3-9-4 炎症细胞因子分析炎症相关血清细胞因子TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-17 和IL-10 使用比色试剂盒（Elabscience，中国）进行分析。 程序遵循试剂盒说明，并使用 ELISA 读取器（Bio Tek，PowerWave XS2，City，State，USA）进行测量。

3-9-5 抗氧化标记物分析 人体中的许多抗氧化酶，如超氧化物歧化酶（SOD）（Elabscience，中国），谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）（biovision，City，State，USA）和过氧化氢酶（CAT )（biovision，城市，州，美国）。 通过 ELISA 试剂盒评估血清中酶的活性。 程序遵循试剂盒说明，并由 ELISA 读取器（Bio Tek，PowerWave XS2，City，State，USA）测量。

3-9-6 微量元素 每个全血样品中约 1 mL 用 3 mL 65% 硝酸（超纯试剂，J.T. Baker）进行微波消解。 随后，研究人员用 2% 的硝酸清洗微波管中的残留物，然后用 0.22 μm 过滤器过滤消化液。 总过滤溶液储存在 15 mL 离心管中。 使用电感耦合等离子体质谱法 (ICP-MS; Agilent 7800) 测定 Pb、Cd、As、Hg、Mn、Al、Tl、V、Na、K、Mg、Ca、Fe、Zn、Se 的含量。

3-9-7 免疫功能分析 在浸润骨骼肌的 T 细胞中，调节性 T 细胞 (Tregs) 是一个主要的亚群。 Tregs可以调节肌肉炎症，促进肌肉再生；然而，衰老肌肉中功能失调的 Tregs 促进了炎症的分解代谢作用。[EbioMedicine。 2019 年 11 月；49：381-388。] 血细胞用单克隆抗体（抗 CD4、-CD25 和 -FoxP3）染色，并通过流式细胞术进行分析。