Влияние ферментированного молока, содержащего штамм Lactobacillus Casei Shirota, на саркопению пожилых людей

1. Зачисление субъектов Определение саркопении основано на алгоритме Азиатской рабочей группы по саркопении (AWGS).

1. Мышечная масса: измерена с помощью Inbody S10 и стандартизирована по росту, показанному индексом скелетных мышц [SMI = аппендикулярная мышечная масса (кг)/рост (м2)]. Низкая мышечная масса определялась как:

   • Мужчины: SMI <7,0 кг/м2
   • Женщины: SMI <5,4 кг/м2

2. Прочность рукоятки: измеряется электронным динамометром для рукоятки. Низкая сила хвата определялась как:

   • Мужчины: <28 кг
   • Женщины: <18 кг

3. Сила конечностей: измеряется по времени 5 раз методом стойки на стуле. Низкая сила конечностей определялась как:

   • Время 5 раз для стояния на стуле: ≥12 с Саркопения определялась по (1) и одному из (2) или (3)

     2. Вмешательство в исследование Испытательные напитки включали ферментированное молоко, ферментированное штаммом L. casei Shirota YIT9029 (LCS), предоставленным компанией Yakult (Тайбэй, Тайвань). Напитки распределялись и хранились при температуре от 0 до 10°C. Ферментационное молоко содержало LCS в количестве более 3x10^8 КОЕ на бутылку объемом 100 мл.

Участники принимали по 2 бутылки в день (104 ккал/день). Исследуемое вмешательство следует проводить два раза в день примерно в одно и то же время. Все молоко будет отправляться участнику еженедельно (14 бутылок в неделю).

3. Оценка исследования 3-1 Антропометрические измерения и оценка состава тела Данные антропометрических измерений определяли рост, вес, окружность талии, окружность мышц рук, окружность бедер и окружность икр с использованием измерительной ленты и весов.

Состав тела определяли с помощью анализа биоэлектрического импеданса (BIA) в качестве неинвазивного тестового инструмента.

3-2 БИА Испытуемые стоят на мете без обуви и носков. Руки не касаются туловищной части тела и естественно разведены под углом 15 градусов от туловища. Ручные электроды имеют маркировку THUMB для большого пальца и MIDDLE для среднего пальца. Электроды для ног должны располагаться между лодыжкой и пяткой обследуемого. Электрический ток подавался от электродов на кончиках пяток обеих стоп и кончиках пальцев обеих рук.

3-3 Мышечная сила Сила хвата, измеренная в стандартных условиях с помощью хорошо изученной модели ручного динамометра с эталонными группами населения, может быть надежным заменителем более сложных измерений мышечной силы в голенях или ногах. Для измерения используется электронный динамометр. Низкая сила хвата определяется у мужчин: <28 кг; Женщины: <18 кг. Сила конечностей измеряется по времени 5 раз для стойки на стуле. Испытуемые садились и вставали пять раз и считали время по таймеру. Низкая сила конечностей определяется по времени на время 5 раз в стойке на стуле: ≥12 с.

3-4 Физическая работоспособность Физическая работоспособность оценивалась с использованием обычной скорости ходьбы на 6 м, TUG и SPPB.

3-5 Скорость ходьбы Участникам было предложено идти с места в нормальном и удобном для них темпе или идти настолько быстро, насколько это возможно, пока участники не достигнут конца отмеченного пути. Обученный экзаменатор шел позади участника и останавливал отсчет времени, когда ступня участника коснулась пола в конце курса ходьбы. Участникам предоставлялись перерывы для отдыха по мере необходимости на протяжении всего сеанса тестирования. Низкая Физическая работоспособность определяется < 1 м/с.

3-6 TUG Участникам было предложено встать со стула, пройти 3 метра вперед и вернуться, чтобы сесть на стул. Низкая Физическая работоспособность определяется ≧ 20 с.

3-7 SPPB Участники были отправлены в SPPB для прохождения теста. Низкая Физическая работоспособность определяется ≦ 9 баллов.

3-8 Общее количество бактерий, состав микробиоты кишечника и анализ метаболитов, полученных из микробиоты

3-8-1 Секвенирование 16S V1-V2 Полную геномную ДНК из образцов экстрагировали из образцов стула с использованием метода CTAB/SDS. Области V1-V2 гена 16S рРНК были отобраны для пиросеквенирования.

3-8-2 Анализ последовательности гена 16S рРНК Данные о последовательности гена 16S рРНК были обработаны с помощью QIIME v 1.8.0 с параметрами по умолчанию. Последовательности были сгруппированы в рабочие таксономические единицы (OTU) с сходством 97%, а затем присвоена таксономия Greengenes с использованием классификатора таксономии консенсуса uclust.

3-8-3 Жирные кислоты с короткой цепью в кале Образцы фекалий разводили в деионизированной воде и гомогенизировали. Для анализа короткоцепочечных жирных кислот (SCFA) использовали супернатант. Экстракцию диэтиловым эфиром проводили по методу Adorno et al.

3-8-4 Определение ИПС и ТМАО Исследователи проанализировали уровни ИПС в сыворотке и фекалиях с помощью ЖХ-МС/МС (4000 QTRAP, город, штат, США).

Концентрации ТМАО в плазме определяли с помощью жидкостной хроматографии с разведением стабильных изотопов (DLM4779-1, Андовер, Массачусетс, США) и тандемной масс-спектрометрии (Ke et al., 2018).

3-8-5 Общее количество бактерий с помощью количественной ПЦР Общее количество бактерий определяли с помощью анализа количественной ПЦР в соответствии с методом, описанным Shima et al. (Beneficial Microbes, 2019) с использованием наборов прямого праймера (UniF: GTGSTGCAYGGYYGTCGTCA) и обратного праймера (UniR: ACGTCRTCCMCNCCTTCCTC). В качестве стандартного штамма использовали Faecalibacterium prausnitzii ATCC27768T.

3-9 Биохимический анализ крови

3-9-1 Образцы крови Образцы крови были взяты у испытуемых до и после испытаний. Образцы крови помещали в пробирки для сбора, содержащие антикоагулянт ЭДТА и гепарин.

3-9-2 Метаболические параметры Все метаболические измерения проводились за один день до начала вмешательства и в конце вмешательства. общий анализ крови, ТТГ, свободный Т4, вит-D, общий холестерин, холестерин ЛПВП, холестерин ЛПНП, триглицериды, глюкоза натощак, инсулин натощак, мочевина крови, азот, преальбумин плазмы, альбумин, АЛТ, АСТ, HbA1c, HS-CRP, Остеокальцин, адипонектин, лептин, серотонин и креатинин измеряли после голодания не менее 8 часов.

3-9-3 Анализ аминокислот в плазме Исследователи использовали анализатор аминокислот Hitachi L-8900 (местоположение) для обнаружения и количественного определения аланина, фенилаланина, цистеина, аспарагиновой кислоты, аспарагина, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, лейцина, изолейцина. , лизин, пролин, аргинин, серин, треонин, валин, триптофан, тирозин и метионин в образцах плазмы.

3-9-4 Анализ воспалительных цитокинов Ассоциированные с воспалением сывороточные цитокины TNF-α, TGF-β, IL-6, IL-17 и IL-10 анализировали с использованием колориметрических наборов (Elabscience, Китай). Процедуры проводились в соответствии с инструкциями набора и измерялись с помощью считывателя ELISA (Bio Tek, PowerWave XS2, город, штат, США).

3-9-5 Анализ антиоксидантных маркеров Многие антиоксидантные ферменты в организме человека, такие как супероксиддисмутаза (SOD) (Elabscience, Китай), глутатионпероксидаза (GPx) (biovision, город, штат, США) и каталаза (CAT ) (биовидение, город, штат, США). Активность ферментов в сыворотке оценивали с помощью набора ELISA. Процедуры проводились в соответствии с инструкциями набора и измерялись с помощью считывателя ELISA (Bio Tek, PowerWave XS2, город, штат, США).

3-9-6 Микроэлементы Приблизительно 1 мл каждого образца цельной крови расщепляли в микроволновой печи с 3 мл 65 % азотной кислоты (сверхчистый реагент, J.T. Baker). Впоследствии исследователи промывали остатки в микроволновых трубках 2% азотной кислотой, а затем фильтровали переваренные жидкости с помощью фильтра 0,22 мкм. Все отфильтрованные растворы хранили в центрифужных пробирках объемом 15 мл. Уровни Pb, Cd, As, Hg, Mn, Al, Tl, V, Na, K, Mg, Ca, Fe, Zn, Se определяли с помощью масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ICP-MS; Agilent 7800).

3-9-7 Анализ иммунной функции Среди Т-клеток, инфильтрирующих скелетные мышцы, регуляторные Т-клетки (Treg) составляют основную часть. Tregs могут регулировать воспаление в мышцах и способствовать регенерации мышц; однако катаболическому эффекту воспаления способствовали дисфункциональные Treg в состарившихся мышцах. [EbioMedicine. 2019 ноябрь; 49: 381-388.] Клетки крови окрашивали моноклональными антителами (анти-CD4, -CD25 и -FoxP3) и анализировали методом проточной цитометрии.