Effetto del latte fermentato contenente il ceppo di Lactobacillus Casei Shirota nella sarcopenia degli anziani

1. Iscrizione del soggetto La definizione di sarcopenia si basa sull'algoritmo dell'Asian Working Group for Sarcopenia (AWGS).

1. Massa muscolare: misurata utilizzando Inbody S10 e standardizzata per altezza, mostrata dall'indice del muscolo scheletrico [SMI= massa muscolare appendicolare (kg)/altezza (m2)]. La massa muscolare bassa è stata definita come:

   • Uomini: SMI <7,0 kg/m2
   • Donne: SMI <5,4 kg/m2

2. Forza dell'impugnatura: misurata con dinamometro elettronico dell'impugnatura. La bassa forza di presa è stata definita come:

   • Uomini: <28 kg
   • Donne: <18 kg

3. Forza dell'arto: misurata dal tempo per 5 volte per il metodo del supporto della sedia. La forza degli arti inferiori è stata definita come:

   • Tempo per 5 volte per alzarsi dalla sedia: ≧12s La sarcopenia è stata definita da (1) e uno di (2), o (3)

     2. Intervento di studio Bevande di prova incluse Fermentazione Latte fermentato con L. casei ceppo Shirota YIT9029 (LCS) fornito dalla Yakult Company (Taipei, Taiwan). Le bevande sono state distribuite e conservate a temperature comprese tra 0 e 10°C. Il latte di fermentazione conteneva LCS a più di 3x10^8 CFU per bottiglia da 100 ml.

I partecipanti prenderebbero 2 bottiglie al giorno (104 Kcal/giorno). L'intervento dello studio dovrebbe essere assunto due volte al giorno all'incirca alla stessa ora. Tutti i latti verrebbero inviati settimanalmente ai partecipanti (14 bottiglie/settimana).

3. Valutazione dello studio 3-1 Misurazione antropometrica e valutazione della composizione corporea I dati di misurazione antropometrica sono stati rilevati altezza, peso, circonferenza della vita, circonferenza del muscolo del braccio, circonferenza dell'anca e circonferenza del polpaccio utilizzando nastro di misurazione e bilancia.

La composizione corporea è stata rilevata utilizzando l'analisi dell'impedenza bioelettrica (BIA) come strumento di test non invasivo.

3-2 BIA I soggetti stanno in piedi senza scarpe e calzini. Le braccia non toccano la parte del tronco del corpo e sono distese naturalmente ad un angolo di 15 gradi rispetto al tronco. Gli elettrodi della mano sono contrassegnati con THUMB per il pollice e MIDDLE per il medio. Gli elettrodi del piede devono essere posizionati tra la caviglia e il tallone dell'esaminato. La corrente elettrica veniva fornita dagli elettrodi sulla punta dei talloni di entrambi i piedi e dalla punta delle dita di entrambe le mani.

3-3 Forza muscolare La forza di presa misurata in condizioni standard con un modello ben studiato di un dinamometro portatile con popolazioni di riferimento può essere un surrogato affidabile per misurazioni più complicate della forza muscolare nella parte inferiore delle braccia o delle gambe. La misurazione utilizza un dinamometro elettronico a impugnatura. La forza di presa bassa è definita negli uomini: <28 kg; Donne: <18 kg. Forza dell'arto misurata dal tempo per 5 volte per il supporto della sedia. I soggetti si sono seduti e in piedi per cinque volte e hanno calcolato il tempo con il timer. La forza dell'arto basso è definita nel tempo per Tempo per 5 volte per la posizione su sedia: ≧12s.

3-4 Prestazioni fisiche Le prestazioni fisiche sono state valutate utilizzando la solita velocità di andatura di 6 metri, TUG e SPPB.

3-5 Velocità dell'andatura Ai partecipanti è stato chiesto di camminare partendo da fermi a un'andatura normale e comoda per loro o di camminare il più velocemente possibile finché i partecipanti non hanno raggiunto la fine del percorso segnato. Un esaminatore esperto camminava dietro il partecipante e interrompeva il cronometraggio quando il piede del partecipante toccava il pavimento alla fine del corso di camminata. Ai partecipanti sono state concesse pause di riposo secondo necessità durante la sessione di test. La prestazione fisica bassa è definita < 1 m/s.

3-6 TUG Ai partecipanti è stato chiesto di alzarsi dalla sedia, camminare per 3 metri in avanti e tornare a sedersi sulla sedia. La prestazione fisica bassa è definita ≧ 20s.

3-7 partecipanti SPPB sono stati seguiti a SPPB per fare il test. La prestazione fisica bassa è definita ≦ 9 punteggi.

3-8 Conta batterica totale, composizione del microbiota intestinale e analisi dei metaboliti derivati ​​dal microbiota

3-8-1 Sequenziamento 16S V1-V2 Il DNA del genoma totale dai campioni è stato estratto dai campioni di feci utilizzando il metodo CTAB/SDS. Le regioni V1-V2 del gene 16S rRNA sono state selezionate per l'analisi di pirosequenziamento.

3-8-2 Analisi della sequenza genica dell'rRNA 16S I dati della sequenza genica dell'rRNA 16S sono stati elaborati con QIIME v 1.8.0 utilizzando parametri predefiniti. Le sequenze sono state raggruppate in unità tassonomiche operative (OTU) con una somiglianza del 97% e quindi assegnate alla tassonomia di Greengenes utilizzando il classificatore di tassonomia del consenso uclust.

3-8-3 Acidi grassi a catena corta fecale I campioni fecali sono stati diluiti in acqua deionizzata e omogeneizzati. Per l'analisi degli acidi grassi a catena corta (SCFA), è stato utilizzato un surnatante. L'estrazione dell'etere dietilico è stata effettuata utilizzando il metodo di Adorno et al.

3-8-4 Determinazione di IPA e TMAO Gli investigatori hanno analizzato i livelli sierici e fecali di IPA utilizzando LC-MS/MS (4000 QTRAP, City, State, USA).

Le concentrazioni plasmatiche di TMAO sono state rilevate mediante spettrometria di massa tandem con cromatografia liquida di diluizione dell'isotopo stabile (DLM4779-1, Andover, MA, USA) (Ke et al., 2018).

3-8-5 Conta batterica totale mediante qPCR La conta batterica totale è stata determinata mediante analisi qPCR secondo il metodo descritto da Shima et al. (Beneficial Microbes, 2019) utilizzando un forward primer (UniF: GTGSTGCAYGGYYGTCGTCA) e un reverse primer (UniR: ACGTCRTCCMCNCCTTCCTC). Faecalibacterium prausnitzii ATCC27768T è stato utilizzato come ceppo standard.

3-9 Analisi biochimiche del sangue

3-9-1 Prelievo di sangue I campioni di sangue sono stati prelevati dai soggetti prima e dopo il test. I campioni di sangue sono stati posti in provette di raccolta contenenti anticoagulante EDTA ed eparina.

3-9-2 Parametri metabolici Tutte le misurazioni metaboliche sono state eseguite un giorno prima dell'inizio dell'intervento e alla fine dell'intervento. Emocromo, TSH, T4 libero, Vit-D, Colesterolo totale, Colesterolo HDL, Colesterolo LDL, Trigliceridi, Glicemia a digiuno, Insulina a digiuno, Urea ematica, Azoto, Prealbumina plasmatica, Albumina, ALT, AST, HbA1c, HS-CRP, osteocalcina, adiponectina, leptina, serotonina e creatinina sono state misurate dopo almeno 8 ore di digiuno.

3-9-3 Analisi degli amminoacidi plasmatici I ricercatori hanno utilizzato un analizzatore di amminoacidi Hitachi L-8900 (posizione) per rilevare e quantificare alanina, fenilalanina, cisteina, acido aspartico, asparagina, acido glutammico, glutammina, glicina, istidina, leucina, isoleucina , lisina, prolina, arginina, serina, treonina, valina, triptofano, tirosina e metionina nei campioni di plasma.

3-9-4 Analisi delle citochine infiammatorie Le citochine sieriche associate all'infiammazione TNF-α, TGF-β, IL-6, IL-17 e IL-10 sono state analizzate utilizzando kit colorimetrici (Elabscience, Cina). Le procedure hanno seguito le istruzioni del kit e sono state misurate utilizzando un lettore ELISA (Bio Tek, PowerWave XS2, City, State, USA).

3-9-5 Analisi dei marker antiossidanti Molti enzimi antiossidanti nel corpo umano, come la superossido dismutasi (SOD) (Elabscience, Cina), la glutatione perossidasi (GPx) (biovision, City, State, USA) e la catalasi (CAT ) (biovisione, Città, Stato, USA). Gli enzimi nel siero sono stati valutati per l'attività mediante kit ELISA. Le procedure hanno seguito le istruzioni del kit e sono state misurate dal lettore ELISA (Bio Tek, PowerWave XS2, City, State, USA).

3-9-6 Oligoelementi Circa 1 mL di ciascun campione di sangue intero è stato digerito in microonde con 3 mL di acido nitrico al 65% (Ultrapure Reagent, J.T. Baker). Successivamente, i ricercatori hanno lavato i residui in tubi a microonde con acido nitrico al 2% e poi hanno filtrato i fluidi digeriti con un filtro da 0,22 μm. Le soluzioni filtrate totali sono state conservate in provette da centrifuga da 15 mL. I livelli di Pb, Cd, As, Hg, Mn, Al, Tl, V, Na, K, Mg, Ca, Fe, Zn, Se sono stati determinati mediante spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente (ICP-MS; Agilent 7800).

3-9-7 Analisi della funzione immunitaria Nei linfociti T che infiltrano il muscolo scheletrico, i linfociti T regolatori (Tregs) costituiscono un sottoinsieme importante. Le Treg possono regolare l'infiammazione nei muscoli e promuovere la rigenerazione dei muscoli; tuttavia, l'effetto catabolico dell'infiammazione è stato promosso dalle Treg disfunzionali nel muscolo invecchiato. [EbioMedicina. 49 novembre 2019: 381-388.] Le cellule del sangue sono state colorate con anticorpi monoclonali (anti-CD4, -CD25 e -FoxP3) e analizzate mediante citometria a flusso.