Efeito do Leite Fermentado Contendo Lactobacillus Casei Cepa Shirota em Idosos com Sarcopenia

1. Inscrição de indivíduos A definição de sarcopenia é baseada no algoritmo do Asian Working Group for Sarcopenia (AWGS).

1. Massa muscular: medida pelo Inbody S10 e padronizada pela altura, apresentada pelo índice de músculo esquelético [IME=massa muscular apendicular (kg)/altura (m2)]. Baixa massa muscular foi definida como:

   • Homens: SMI <7,0 kg/m2
   • Mulheres: SMI <5,4 kg/m2

2. Força de preensão palmar: medida por dinamômetro eletrônico de preensão manual. Baixa força de preensão manual foi definida como:

   • Homens: <28 kg
   • Mulheres: <18 kg

3. Força dos membros: medida pelo tempo por 5 vezes para o método de suporte de cadeira. Força de membros inferiores foi definida como:

   • Tempo por 5 vezes para levantar da cadeira: ≧12s Sarcopenia foi definida por (1) e um de (2), ou (3)

     2. Intervenção do estudo Bebidas de teste incluídas Fermentação Leite fermentado com L. casei cepa Shirota YIT9029 (LCS) fornecido pela Yakult Company (Taipei, Taiwan). As bebidas foram distribuídas e armazenadas em temperaturas variando de 0-10°C. O Leite de Fermentação continha LCS em mais de 3x10^8 CFU por garrafa de 100 ml.

Os participantes tomariam 2 frascos por dia (104 Kcal/dia). A intervenção do estudo deve ser tomada duas vezes ao dia aproximadamente no mesmo horário. Todos os leites seriam enviados ao participante semanalmente (14 mamadeiras/semana).

3. Avaliação do estudo 3-1 Medição antropométrica e avaliação da composição corporal Dados de medição antropométrica foram detectados: altura, peso, circunferência da cintura, circunferência muscular do braço, circunferência do quadril e circunferência da panturrilha usando fita métrica e balança.

A composição corporal foi detectada usando a análise de impedância bioelétrica (BIA) como um instrumento de teste não invasivo.

3-2 BIA Sujeitos ficam de pé sem sapatos e meias. Os braços não tocam a parte do tronco do corpo e são abertos naturalmente em um ângulo de 15 graus em relação ao tronco. Os eletrodos de mão são marcados THUMB para o polegar e MÉDIO para o dedo médio. Os eletrodos do pé devem ser posicionados entre o tornozelo e o calcanhar do examinado. A corrente elétrica foi fornecida a partir dos eletrodos nas pontas dos calcanhares de ambos os pés e nas pontas dos dedos de ambas as mãos.

3-3 Força muscular A força de preensão medida em condições padrão com um modelo bem estudado de um dinamômetro portátil com populações de referência pode ser um substituto confiável para medidas mais complicadas de força muscular nos antebraços ou pernas. A medição usa dinamômetro de aperto de mão eletrônico. Baixa força de preensão manual é definida em Homens: <28 kg; Mulheres: <18kg. Força dos membros medida pelo tempo por 5 vezes para o suporte da cadeira. Os sujeitos sentaram e levantaram cinco vezes e calcularam o tempo pelo cronômetro. Força de membro baixa é definida no tempo para Tempo por 5 vezes para levantar da cadeira: ≧12s.

3-4 Desempenho físico O desempenho físico foi avaliado usando a velocidade de marcha usual de 6 metros, TUG e SPPB.

3-5 Velocidade da marcha Os participantes foram instruídos a caminhar de pé em um ritmo normal e confortável para eles ou a caminhar o mais rápido possível até que chegassem ao final do caminho marcado. Um examinador treinado andou atrás do participante e parou de cronometrar quando o pé do participante tocou o chão no final do percurso de caminhada. Os participantes tiveram intervalos de descanso conforme necessário durante a sessão de teste. Baixo Desempenho físico é definido como < 1 m/s.

3-6 TUG Os participantes foram instruídos a levantar da cadeira, andar 3 metros para frente e voltar a sentar na cadeira. Baixo desempenho físico é definido ≧ 20s.

3-7 SPPB Os participantes foram acompanhados ao SPPB para fazer o teste. Baixo desempenho físico é definido ≦ 9 escores.

3-8 Contagem total de bactérias, composição da microbiota intestinal e análise de metabólitos derivados da microbiota

3-8-1 Sequenciamento de 16S V1-V2 O DNA total do genoma das amostras foi extraído de amostras de fezes usando o método CTAB/SDS. As regiões V1-V2 do gene 16S rRNA foram selecionadas para análise de pirosequenciamento.

3-8-2 Análise da sequência do gene 16S rRNA Os dados da sequência do gene 16S rRNA foram processados ​​com QIIME v 1.8.0 usando parâmetros padrão. As sequências foram agrupadas em unidades taxonômicas operacionais (OTUs) com 97% de similaridade e, em seguida, atribuídas à taxonomia de Greengenes usando o classificador de taxonomia de consenso uclust.

3-8-3 Ácidos Graxos Fecais de Cadeia Curta As amostras fecais foram diluídas em água deionizada e homogeneizadas. Para análise de ácidos graxos de cadeia curta (SCFA), um sobrenadante foi usado. A extração com éter dietílico foi realizada pelo método de Adorno et al.

3-8-4 Determinação de IPA e TMAO Os investigadores analisaram os níveis séricos e fecais de IPA usando LC-MS/MS (4000 QTRAP, cidade, estado, EUA).

As concentrações plasmáticas de TMAO foram detectadas por cromatografia líquida de diluição de isótopos estáveis ​​(DLM4779-1, Andover, MA, EUA) e espectrometria de massa em tandem (Ke et al., 2018).

3-8-5 Contagem bacteriana total por qPCR As contagens bacterianas totais foram determinadas por análise qPCR de acordo com o método descrito por Shima et al. (Beneficial Microbes, 2019) usando um primer direto (UniF: GTGSTGCAYGGYYGTCGTCA) e um primer reverso (UniR: ACGTCRTCCMCNCCTTCCTC). Faecalibacterium prausnitzii ATCC27768T foi usado como cepa padrão.

3-9 Análises bioquímicas do sangue

3-9-1 Amostragem de sangue Amostras de sangue foram coletadas dos sujeitos antes e depois do teste. As amostras de sangue foram colocadas em tubos coletores contendo anticoagulante EDTA e heparina.

3-9-2 Parâmetros metabólicos Todas as medições metabólicas foram realizadas um dia antes do início da intervenção e no final da intervenção. CBC, TSH, T4 Livre, Vit-D, Colesterol total, HDL-colesterol, LDL-colesterol, triglicerídeos, glicose em jejum, insulina em jejum, ureia no sangue, nitrogênio, pré-albumina plasmática, albumina, ALT, AST, HbA1c, HS-CRP, osteocalcina, adiponectina, leptina, serotonina e creatinina foram medidos após jejum de pelo menos 8 horas.

3-9-3 Análise de Aminoácidos Plasmáticos Os investigadores usaram um Analisador de Aminoácidos Hitachi L-8900 (Localização) para detectar e quantificar alanina, fenilalanina, cisteína, ácido aspártico, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, leucina, isoleucina , lisina, prolina, arginina, serina, treonina, valina, triptofano, tirosina e metionina nas amostras de plasma.

3-9-4 Análise de citocinas inflamatórias As citocinas séricas associadas à inflamação TNF-α, TGF-β, IL-6, IL-17 e IL-10 foram analisadas usando kits colorimétricos (Elabscience, China). Os procedimentos seguiram as instruções do kit e foram medidos usando um leitor de ELISA (Bio Tek, PowerWave XS2, City, State, EUA).

3-9-5 Análise de marcadores antioxidantes Muitas enzimas antioxidantes em corpos humanos, como superóxido dismutase (SOD) (Elabscience, China), glutationa peroxidase (GPx) (biovision, cidade, estado, EUA) e catalase (CAT ) (biovisão, cidade, estado, EUA). As enzimas no soro foram avaliadas quanto à atividade pelo kit ELISA. Os procedimentos seguiram as instruções do kit e foram medidos pelo leitor de ELISA (Bio Tek, PowerWave XS2, City, State, USA).

3-9-6 Oligoelementos Aproximadamente 1 mL de cada amostra de sangue total foi digerido por micro-ondas com 3 mL de ácido nítrico a 65% (Ultrapure Reagent, J.T. Baker). Posteriormente, os investigadores lavaram os resíduos em tubos de microondas com 2% de ácido nítrico e depois filtraram os fluidos digeridos com filtro de 0,22 μm. As soluções totais filtradas foram armazenadas em tubos de centrífuga de 15 mL. Os níveis de Pb, Cd, As, Hg, Mn, Al, Tl, V, Na, K, Mg, Ca, Fe, Zn, Se foram determinados por espectrometria de massa com plasma acoplado indutivamente (ICP-MS; Agilent 7800).

3-9-7 Análise da função imunológica Nas células T que se infiltram no músculo esquelético, as células T reguladoras (Tregs) são um subconjunto importante. Tregs pode regular a inflamação no músculo e promover a regeneração do músculo; no entanto, o efeito catabólico da inflamação foi promovido pelas Tregs disfuncionais no músculo envelhecido. [EbioMedicine. 2019 novembro;49:381-388.] As células sanguíneas foram coradas com anticorpos monoclonais (anti-CD4, -CD25 e -FoxP3) e analisadas por citometria de fluxo.