Wpływ sfermentowanego mleka zawierającego Lactobacillus Casei szczep Shirota na sarkopenię w podeszłym wieku

1. Rejestracja pacjentów Definicja sarkopenii opiera się na algorytmie Asian Working Group for Sarcopenia (AWGS).

1. Masa mięśniowa: mierzona za pomocą Inbody S10 i standaryzowana na podstawie wzrostu, wyrażona wskaźnikiem mięśni szkieletowych [SMI=masa mięśni kończyn dolnych (kg)/wzrost (m2)]. Niską masę mięśniową zdefiniowano jako:

   • Mężczyźni: SMI <7,0 kg/m2
   • Kobiety: SMI <5,4 kg/m2

2. Siła chwytu: mierzona za pomocą elektronicznego dynamometru. Niską siłę chwytu dłoni zdefiniowano jako:

   • Mężczyźni: <28 kg
   • Kobiety: <18 kg

3. Siła kończyny: mierzona przez Time 5 razy dla metody stania na krześle. Siłę kończyny dolnej zdefiniowano jako:

   • Czas 5 razy na wstanie na krześle: ≧12s Sarkopenia została zdefiniowana przez (1) i jedno z (2) lub (3)

     2. Interwencja w badaniu Napoje testowe obejmowały Mleko Fermentacyjne fermentowane z L. casei szczep Shirota YIT9029 (LCS) dostarczone przez Yakult Company (Tajpej, Tajwan). Napoje rozprowadzano i przechowywano w temperaturach w zakresie 0-10°C. Mleko Fermentacyjne zawierało LCS w ilości ponad 3x10^8 CFU na 100 ml butelkę.

Uczestnicy przyjmowali 2 butelki dziennie (104 kcal/dzień). Interwencja badawcza powinna być podejmowana dwa razy dziennie, mniej więcej o tej samej porze. Wszystkie mleka byłyby wysyłane do uczestnika co tydzień (14 butelek/tydzień).

3. Ocena badania 3-1 Pomiar antropometryczny i ocena składu ciała Dane z pomiarów antropometrycznych wykryto wzrost, wagę, obwód talii, obwód mięśni ramienia, obwód bioder i obwód łydki za pomocą taśmy mierniczej i wagi.

Skład ciała został wykryty za pomocą analizy impedancji bioelektrycznej (BIA) jako nieinwazyjnego instrumentu testowego.

3-2 BIA Badani stoją na mecie bez butów i skarpetek. Ramiona nie dotykają tułowia i są naturalnie rozłożone pod kątem 15 stopni od tułowia. Elektrody dłoni są oznaczone jako KCIUK dla kciuka i ŚRODKOWY dla środkowego palca. Elektrody stopy należy umieścić między kostką a piętą badanego. Prąd elektryczny dostarczano z elektrod umieszczonych na końcach pięt obu stóp oraz na opuszkach palców obu dłoni.

3-3 Siła mięśniowa Siła chwytu mierzona w standardowych warunkach za pomocą dobrze przebadanego modelu ręcznego dynamometru z populacjami referencyjnymi może być wiarygodnym substytutem bardziej skomplikowanych pomiarów siły mięśni przedramion lub nóg. Do pomiaru wykorzystuje się elektroniczny dynamometr ręczny. Niska siła chwytu dłoni określana jest u mężczyzn: <28 kg; Kobiety: <18kg. Siła kończyny mierzona przez Time 5 razy dla stojaka na krzesło. Badani siedzieli i stali pięć razy i obliczali czas za pomocą timera. Siła kończyny dolnej jest określana w czasie dla Czasu 5 razy dla stania na krześle: ≧12s.

3-4 Sprawność fizyczna Sprawność fizyczną oceniono na podstawie zwykłej prędkości chodu na dystansie 6 metrów, TUG i SPPB.

3-5 Szybkość chodu Uczestnicy zostali poinstruowani, aby szli ze startu stojącego w tempie, które było dla nich normalne i wygodne, lub szli tak szybko, jak tylko mogli uczestnicy, aż dotarli do końca wyznaczonej ścieżki. Przeszkolony egzaminator szedł za uczestnikiem i zatrzymywał pomiar czasu, gdy stopa uczestnika dotknęła podłogi na końcu trasy marszu. Uczestnikom zapewniono przerwy na odpoczynek w razie potrzeby podczas sesji testowej. Niska Wydajność fizyczna jest zdefiniowana jako < 1 m/s.

3-6 Uczestników TUG polecono wstać z krzesła, przejść 3 metry do przodu i wrócić, aby usiąść na krześle. Niska sprawność fizyczna jest zdefiniowana ≧ 20s.

3-7 uczestników SPPB było śledzonych do SPPB w celu wykonania testu. Niska sprawność fizyczna jest zdefiniowana ≦ 9 punktów.

3-8 Całkowita liczba bakterii, skład mikroflory jelitowej i analiza metabolitów pochodzących z mikrobiomu

3-8-1 Sekwencjonowanie 16S V1-V2 Całkowity genomowy DNA z próbek ekstrahowano z próbek kału metodą CTAB/SDS. Regiony V1-V2 genu 16S rRNA wybrano do analizy pirosekwencjonowania.

3-8-2 Analiza sekwencji genu 16S rRNA Dane sekwencji genu 16S rRNA przetwarzano za pomocą QIIME v 1.8.0 przy użyciu parametrów domyślnych. Sekwencje pogrupowano w operacyjne jednostki taksonomiczne (OTU) z 97% podobieństwem, a następnie przypisano taksonomię Greengenes przy użyciu konsensusowego klasyfikatora taksonomii uclust.

3-8-3 Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe w kale Próbki kału rozcieńczano wodą dejonizowaną i homogenizowano. Do analizy krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA) zastosowano supernatant. Ekstrakcję eterem dietylowym przeprowadzono metodą Adorno i in.

3-8-4 Oznaczanie IPA i TMAO Badacze przeanalizowali poziomy IPA w surowicy iw kale za pomocą LC-MS/MS (4000 QTRAP, miasto, stan, USA).

Stężenia TMAO w osoczu wykrywano za pomocą tandemowej spektrometrii mas z chromatografią cieczową z rozcieńczeniami stabilnego izotopu (DLM4779-1, Andover, MA, USA) (Ke i in., 2018).

3-8-5 Całkowita liczba bakterii metodą qPCR Całkowitą liczbę bakterii określono metodą analizy qPCR zgodnie z metodą opisaną przez Shima i in. (Beneficial Microbes, 2019) przy użyciu zestawów starterów do przodu (UniF: GTGSTGCAYGGYYGTCGTCA) i starterów do tyłu (UniR: ACGTCRTCCMCNCCTTCCTC). Faecalibacterium prausnitzii ATCC27768T zastosowano jako szczep standardowy.

3-9 Analizy biochemiczne krwi

3-9-1 Pobieranie krwi Próbki krwi pobrano od pacjentów przed i po teście. Próbki krwi umieszczono w probówkach do pobierania zawierających antykoagulant EDTA i heparynę.

3-9-2 Parametry metaboliczne Wszystkie pomiary metaboliczne przeprowadzono jeden dzień przed rozpoczęciem interwencji i na koniec interwencji. CBC, TSH, Wolna T4, Wit-D, Cholesterol całkowity, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, trójglicerydy, glukoza na czczo, insulina na czczo, mocznik we krwi, azot, prealbumina osocza, albuminy, ALT, AST, HbA1c, HS-CRP, osteokalcynę, adiponektynę, leptynę, serotoninę i kreatyninę mierzono po co najmniej 8-godzinnym poście.

3-9-3 Analiza aminokwasów w osoczu Badacze wykorzystali analizator aminokwasów Hitachi L-8900 (lokalizacja) do wykrycia i oznaczenia ilościowego alaniny, fenyloalaniny, cysteiny, kwasu asparaginowego, asparaginy, kwasu glutaminowego, glutaminy, glicyny, histydyny, leucyny, izoleucyny , lizyny, proliny, argininy, seryny, treoniny, waliny, tryptofanu, tyrozyny i metioniny w próbkach osocza.

3-9-4 Analiza cytokin zapalnych Cytokiny surowicy związane z zapaleniem, TNF-α, TGF-β, IL-6, IL-17 i IL-10, analizowano przy użyciu zestawów kolorymetrycznych (Elabscience, Chiny). Procedury były zgodne z instrukcjami zestawu i były mierzone przy użyciu czytnika ELISA (Bio Tek, PowerWave XS2, miasto, stan, USA).

3-9-5 Analiza markerów antyoksydacyjnych Wiele enzymów przeciwutleniających w organizmach ludzkich, takich jak dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) (Elabscience, Chiny), peroksydaza glutationowa (GPx) (biovision, miasto, stan, USA) i katalaza (CAT ) (biowizja, miasto, stan, USA). Aktywność enzymów w surowicy oceniano za pomocą zestawu ELISA. Procedury były zgodne z instrukcjami zestawu i były mierzone za pomocą czytnika ELISA (Bio Tek, PowerWave XS2, miasto, stan, USA).

3-9-6 Pierwiastki śladowe Około 1 ml każdej próbki krwi pełnej trawiono mikrofalami 3 ml 65% kwasu azotowego (Ultrapure Reagent, J.T. Baker). Następnie badacze wypłukali pozostałości w probówkach mikrofalowych z 2% kwasem azotowym, a następnie przefiltrowali strawione płyny przez filtr 0,22 μm. Całkowite przefiltrowane roztwory przechowywano w 15 ml probówkach do wirowania. Poziomy Pb, Cd, As, Hg, Mn, Al, Tl, V, Na, K, Mg, Ca, Fe, Zn, Se oznaczono za pomocą spektrometrii masowej z plazmą indukcyjnie sprzężoną (ICP-MS; Agilent 7800).

3-9-7 Analiza funkcji immunologicznych W limfocytach T naciekających mięśnie szkieletowe głównym podzbiorem są limfocyty T regulatorowe (Treg). Tregs mogą regulować stany zapalne w mięśniach i promować regenerację mięśni; jednak kataboliczny efekt zapalenia był promowany przez dysfunkcyjne Treg w starzejących się mięśniach. [EbioMedicine. 2019 listopad;49:381-388.] Komórki krwi barwiono przeciwciałami monoklonalnymi (anty-CD4, -CD25 i -FoxP3) i analizowano metodą cytometrii przepływowej.